辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）RxLR效应分子克隆及RxLR23同源基因的功能研究

发布时间：2020-06-04 19:53

【摘要】：辣椒疫霉病是世界上普遍存在的土传性土壤病害,其危害范围极其广泛,每年对全世界范围内的蔬菜生产造成极大的破坏和影响。全世界上有关辣椒疫霉病最早进行记载的是Leonian(1892),他在墨西哥发现了辣椒疫霉病,并确定了病原菌是Phytophthora capsici。关于辣椒疫霉病的防治,目前主要是化学农药防治,同时,也带来了众多农药残留、植株抗药性增强等一系列问题;另一方面,由于辣椒疫霉菌具有很强的变异能力,增加了抗病品种研发的难度。总体而言,辣椒疫霉病的防控是中国乃至全世界范围内的一个巨大难题,需要近一步深入研究。辣椒疫霉是植物病原卵菌中重要的病原菌,其存在大量的RxLR效应因子,辣椒疫霉侵染植物宿主过程中会产生较多的RxLR效应分子,对植物的抗病反应造成破坏和影响。所以,研究辣椒疫霉RxLR效应因子的功能和结构,对了解辣椒疫霉致病机理,控制疫霉病发展具有重要意义。本研究是以本实验室采集、分离和保存的高致病性的辣椒疫霉SD33为实验材料,结合相关的深入研究,对本实验室辣椒疫霉菌株SD33中的RxLR效应分子进行了如下研究:1.根据JGI辣椒疫霉菌基因组数据库,对辣椒疫霉RxLR效应分子基因进行筛选、克隆和生物信息学的分析。通过NCBI的序列对比,经过功能的研究,确定筛选的效应因子。2.提取辣椒疫霉SD33基因组DNA,克隆辣椒疫霉基因组的效应因子,进行生物信息学预测及分析。将福建、江西等地的辣椒疫霉菌株(小种)与SD33筛选的RxLR23进行比对,选取RxLR3-1、RxLR6-2、RxLR8-2作为同源基因进行研究。3.将效应因子RxLR84、RxLR23、RxLR3-1、RxLR6-2、RxLR8-2融合到pBIN-GFP2表达载体上,转农杆菌后,在本氏烟、辣椒上瞬时表达,观察表型,发现RxLR84抑制Bax的坏死,用Western blot技术检测其表达。分析这些效应因子的亚细胞定位,结果发现,RxLR84、RxLR23主要定位于细胞核和细胞质,RxLR3-1、RxLR6-2和RxLR8-2主要定位在细胞质。4.将效应因子RxLR23、RxLR3-1、RxLR6-2接种本氏烟,24h接种辣椒疫霉游动孢子,3d后观察结果。RxLR23、RxLR6-2能促进辣椒疫霉游动孢子的侵染,RxLR3-1对辣椒疫霉游动孢子侵染有所抑制。5.核定位和核输出信号对RxLR23功能的影响。将RxLR23分别加入核定位信号(NLS)和核输出信号(NES),对其功能进行进一步研究,发现RxLR23NLS依旧引起辣椒坏死,RxLR23NES基本不引起辣椒坏死,RxLR23NLS、RxLR23NES接种本氏烟,24h后接辣椒疫霉游动孢子,发现RxLR23NLS抑制其侵染、RxLR23NES促进辣椒疫霉侵染。通过以上研究,我们发现不同的RxLR效应因子具有多样性功能,部分效应因子在抑制INF1或Bax的坏死上起到一定作用,同源效应基因在部分氨基酸的多态性位点下,基因功能上会有所差异,核输出信号会导致RxLR23的功能改变,核输出信号会导致RxLR23抑制辣椒疫霉侵染。经过一系列的深入探讨,我们发现RxLR23是具有毒性的效应因子,能引起植物细胞的死亡,效应因子的致病机理通常是植物体内有与其互作的蛋白,筛选出相应的互作蛋白,研究出效应因子与互作蛋白的内在关系,才能更加完整的解释效应因子的致病机理。
【图文】：

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现在的研究观点认为植物免疫系统包括两个层面，植物的免疫系统与病原菌的相互作用可以分为四个阶段，总结为一个“之”字形的“zigzag”模式（图 1-1）。图1-1 卵菌-植物互作的“zigzag”模式（modified from Jones and Dangl, 2006）图中所示的是由卵菌病原物相关分子模式（PAMPs）和其他激发子所引发的 PTI 免疫反应和 PCD 坏死〔超过 PTI 临界值的表示程序性细胞死亡（PCD），图中虚线部分〕；卵菌的效应因子触发的敏感性（ETS）；寄主的抗性蛋白检测到卵菌的效应因子所触发的免疫反应（ETI）。Y 轴表示的是植物防卫反应的强弱程度；同时标注了 PCD 的临界值。CELL，纤维素结合诱导凝集素；CRN，皱缩和坏死蛋白；NLP，Nep1类似蛋白； PRR，模式识别受体； R，抗性；SCR

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图1-2 RXLR 效应蛋白进入寄主细胞的模式图（图片引自 William Morgan and Sophien Kamoun., 2007Fig.1-2 Ahypothetical model for RXLR effector secretion and delivery into host cell （adapted from William MSophien Kamoun., 2007）目前，在卵菌中一种新的病原相关模式被发现，揭示了病原菌攻击寄主细胞致病机制-“诱饵模式”（Ma et al., 2017; Wirthmueller et al., 2013; Xiang et al., 200et al., 2004; Mackey et al., 2003），是在疫霉菌入侵植物的早期阶段疫霉菌病原物基水解酶 XEG1入侵植物细胞壁，而植物则利用水解酶抑制子 GIP1抑制它的活性个进化的过程中，疫霉菌又获得了 XEG1的失活的突变体 XLP1，XLP1与植物GIP1结合能力比 XEG1要高出5倍，进而以诱饵“DECOY”的方式对抑制子 GIP1扰，与糖基水解酶 XEG1一同攻击植物的抗病性。由于糖基水解酶 XEG1在一些广泛存在，所以，这为研发能诱导植物广谱抗病性的生物农药提供了重要的理论1.5 研究的目的及意义
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.44

【参考文献】