刺肩蝽Thanatin抗菌肽基因对烟草青枯病耐受性影响

发布时间：2020-06-04 21:44

【摘要】：烟草青枯病是由茄青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的带有土壤传播特性的病害,导致烟草青枯病症的发生,青枯病菌可以在土壤里或者病残体里越冬,残留的病菌会继续危害烟草的生产。青枯病为细菌性维管束病害,运用传统的病害防治方法可以综合防治和控制青枯病的爆发,但是会耗费大量的人力物力资源,而且化学防治往往还伴随着环境污染以及致病菌耐药性的问题,另外,青枯病害一旦大规模爆发,几乎没有有效的救治手段。因此,开发具有青枯病耐受性并能稳定遗传的烟草种质资源有着切实的应用价值。杂交育种是常规的育种方式,但是在烟草防治青枯病上,缺乏明确的抗原,而在诱变育种方式中,诱发突变的方向难以掌握,有效耐受青枯病害的突变体烟草植株难以获得。通过转基因育种的方法,可以快速地在烟草基因组中整合有益的目的基因,使烟草获得对青枯病的高抗性。不仅如此,青枯病菌侵害的寄主十分广泛,其中包含有重要的经济作物、蔬菜和粮食,病害同样会造成这些寄主严重的作物减产以及经济损失等问题。通过转基因烟草对青枯病耐受性的研究,明确在植物体内异源表达的待选基因对青枯菌的抑制能力,同样能指导其它重要经济作物等的转基因抗青枯病材料的研发。刺肩蝽的抗菌肽死亡素Thanatin,是具有β-折叠结构的最小的昆虫抗菌肽,仅有21个氨基酸残基,其分子量小、抗菌谱广和高效性成为了理想的转基因肽的备选基因。有研究表明,番茄(Solanum lycopersicum)中转入抗菌肽CecB基因,转基因株系获得了对青枯病的耐受力;水稻和拟南芥异源表达Thanatin,分别获得了抗稻瘟病的水稻以及对真菌抗性提高的拟南芥叶片。这些抗性转基因材料的研发,为植物抗病性的研究提供了理论依据。本研究将带有分泌肽(SP)编码序列的Thanatin基因由CaMV 35S启动子控制,经农杆菌介导转化裸茎烟草,获得整合有Thanatin的转基因植株,分析T1代植株Thanatin基因的表达水平,烟草植株通过伤根浇灌法接种青枯菌,分析烟草病害指数、叶片叶绿素含量变化以及分离培养根茎结合部位组织,探讨外源Thanatin对转基因植株的青枯病耐受性的影响,为转基因抗青枯病烟草的培育和研究提供理论依据。主要研究结果如下:1、构建了含有2x35S::spThanatin基因的双元表达载体将公司合成的融合有烟草PR-1基因分泌信号肽Sp编码序列的刺肩蝽抗菌肽Thanatin基因spThanatin与CaMV 35S启动子相连,构建了含有2x35S::spThanatin基因的双元表达载体pVCT2365p5。2、获得了烟草转基因T1代植株并明确了Thanatin基因的表达水平通过农杆菌介导法,利用LBA4404(pVCT2365p5)转化烟草叶片外植体,在含卡那霉素(Kan)的烟草分化培养基中进行分化筛选,获得了具有Kan抗性的组培苗9株,再通过PCR检测组培苗中的thanatin基因,筛选出了转thanatin基因的阳性植株L4、L5、L7、L8和L9。PCR扩增筛选出每个株系T1代群体中的阳性单株,随机剪取每个株系内的三个阳性植株叶片,混样提取RNA,反转录合成单链cDNA;通过SYBR GREEN qRT-PCR检测和分析thanatin基因的表达量,以T1代株系L5的表达量为基准数1,T1代株系L4、L7、L8、L9相较于T1代株系L5分别有3、3.2、25.6、4.5倍的相对表达水平。3、Thanatin基因异源表达增强了转基因烟草对青枯病的耐受性L4、L5、L8转基因烟草株系和WT野生型烟草通过伤根浇灌法活体接种青枯菌,烟草青枯病病害早期阶段,植株叶片的萎焉是可逆的并且不伴随叶绿素含量的变化,随着病害进程的加重,植株叶片变为黄褐色枯萎状,叶片病害部位由叶柄开始,从叶脉向四周扩散;分离接种处理后的L8株系及WT野生型烟草根茎结合部组织,表面消毒后纵切,纵切面涂布于TTC培养基上均能长出红色菌落,表明青枯成功感染植株,并在植株体内繁殖扩散。L4、L5株系和WT烟草有相近似的病害指数数值,L8株系在各个处理中的时期,有明显低于其它三个株系的病害指数;从病害指数趋势上分析,L8株系相较于其它三个处理株系,可以在青枯菌接种早期抑制病菌的繁殖,延缓青枯病的病发,延长烟草的存活时间,说明相对表达水平较高的thanatin基因提高了烟草植株对青枯病的耐受性,表明了thanatin基因较强异源表达增强了转基因烟草对青枯病的耐受性。
【图文】：

序列,抗菌肽,作用机制

图 1-1 抗菌肽经典的作用机制。Fig. 1-1. The classic action mechanism of antibacterial peptide .几十年的研究已经积累了大量关于 AMP 的信息，这些信息可以在 AMP 数据库中管理和查询[4]。随着新的 AMPs 被发现，这些数据库还会得到进一步扩展。抗菌肽数据库(APD3)包含 2,169 个抗菌、172 个抗病毒、105 个抗艾滋病病毒、959 个抗真菌、80 个抗寄生虫和 185 个抗癌肽[4]。在抗菌的抗菌肽中，大多数是来源于细菌的细菌肽，，而其他的则来自古细菌、原生生物、真菌、植物和动物[4]。ADAM(抗微生物肽数据库)是另一个有用的 AMP 数据库，包含 7,007 个独特的序列和 759 个结构。CAMP R3(抗微生物肽的收集)数据库可以查询 AMP 序列及其命名[17]。1.2.2 抗菌肽的潜在作用价值目前为止，超过 1700 中天然抗菌肽已被鉴别，通过天然抗菌肽作为模板，数千种衍生物和类似物已被电脑设计、合成[18]。网站资源和数据库提供大量关于天然及合成抗菌肽的信息（表 1-1）。这些资源和数据库提供方便的搜索工具来搜索期望的特质，提供多种分析和预测工具，并且帮组促进提高医疗指数或者抗菌特质的新型抗菌肽的发现

中间载体,酶切鉴定,片段,初步筛选

4.1.1.1 中间载体 pVCT1404p1 的 PCR 鉴定及酶切鉴定回收 pVCT1398p1 和 pVCT2405p1 酶切 365bp 和 7515bp 的目的片段（图 4-2A、4经 T4DNA 连接酶连接后转化，从平板上随机挑选数个克隆，用引物 p240p257B 进行筛选得到 819bp 预期大小的片段（图 4-2C）。挑取菌落 PCR 扩增初步筛选的阳性克菌提取质粒，进行 NcoI 酶切鉴定，获得 5336bp+2544 预期大小的片段（图 4-2D）落 PCR 扩增鉴定和酶切鉴定后，表明中间载体 pVCT1404p1 构建成功。182028DABDMb 123 4 M M 2930365bp7515bpM 5 6 7 8 91011 1213 14 15 16 1719 21 222324252627
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.72

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