磷在原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的转运吸收及相关磷转运载体基因表达的研究

发布时间：2020-06-04 22:00

【摘要】：在本实验室前期系列肉仔鸡磷营养研究成果的基础上,本研究通过进行如下三个试验,研究建立体外原代培养AA肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞吸收模型,并应用此模型研究磷在原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中的吸收规律及其对相关磷转运载体的表达。试验一研究不同接种密度及不同培养时间对原代培养AA肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞紧密连接性及细胞活力的影响,最终构建十二指肠上皮细胞原代培养吸收模型。该试验采用单因子完全随机试验设计,设3个细胞接种密度[2.9×10~6个/mL(一组)、6.2×10~6个/mL(二组)与8.8×10~6个/mL(三组)],共3个处理组,每个处理组6个重复,共培养4天。结果表明:1)刚分离的十二指肠上皮细胞团呈球形,且细胞团的大小均一,悬浮于培养液中,贴壁后细胞团开始向外伸展,逐渐铺成片,细胞之间界限清晰、贴壁均匀,呈单层“铺路石样”生长;2)经碱性磷酸酶染色,阳性处理组的十二指肠上皮细胞胞浆被染成了蓝黑色,阴性对照组的十二指肠上皮细胞不着色,本试验所培养的细胞均为十二指肠上皮细胞;3)在细胞培养的48和72 h,一组和二组细胞的跨膜电阻(Transepithelial Electrical Resistance,TEER)值(分别为:458、467Ω·cm~2(一组),411、380Ω·cm~2(二组))均满足大于300Ω·cm~2的试验要求,酚红透过率(分别为:2.20、1.19%(一组),3.09、1.81%(二组))均满足小于5%的试验要求,并且一组的跨膜电阻TEER值均显著大于其它两组(P0.03),细胞酚红透过率均显著小于其它两组(P0.002);4)在细胞培养的24和48 h,一组的LDH酶活力较其他两组均维持在较低水平(P0.0001)。以上结果表明,细胞接种密度为2.9×10~6个/mL与培养时间为48h时,细胞间界限清晰、生长状态良好、紧密连接性强,细胞活力最佳,即表明原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞物质吸收模型构建成功,为后续磷在十二指肠上皮细胞的吸收规律及其分子机制的研究提供了良好的试验模型。试验二研究不同磷孵育时间下原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中的转运吸收规律,根据磷的吸收与孵育时间的曲线关系以确定细胞最佳孵育时间,为在细胞最敏感的状态下研究磷的吸收提供试验依据。该研究采用单因子完全随机试验设计,设8个磷孵育时间点(0、10、20、40、60、80、100和120 min),共8个处理组,每个处理组6个重复。结果表明:在细胞进行磷孵育不同时间点,十二指肠上皮细胞的磷吸收率存在显著差异(P0.0001)。在孵育时间0-80 min之间,细胞磷吸收率随着磷孵育时间的增加而线性增加,在这一线性增加的时间范围内,选择中间位置时间点40 min作为研究不同孵育浓度下细胞磷吸收动力学规律的最佳孵育时间;用二次曲线、渐近线、断线三种曲线拟合的方法对磷吸收率数据拟合相应的曲线模型发现,以渐近线法拟合曲线模型的拟合度最好,因此选用渐近线拟合模型求出的磷吸收率达到饱和的时间点为87min,作为研究不同磷孵育浓度下细胞磷吸收相关转运载体表达的分子机制的最佳孵育时间。试验三在试验二确定最佳孵育时间的基础上,研究不同磷孵育浓度下磷在原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中的动力学吸收规律及其对相关转运载体基因表达的影响。该研究采用单因子的完全随机试验设计,设计8个磷水平0.0、0.75、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0和48.0 mmol/L的含磷孵育液,共8个处理组,每个处理组6个重复,在孵育时间40 min时研究不同磷孵育浓度下细胞中磷吸收动力学规律,在孵育时间87 min时研究不同磷孵育浓度(0.0、6.0和48.0 mmol/L)下磷相关转运载体表达的分子机制。结果表明:1)在不同的磷孵育水平下,肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞磷吸收率呈线性或曲线显著增加(P0.0001),并且原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞对磷的吸收动力学规律最适合饱和载体转运加非饱和扩散模型;2)孵育液中添加磷(6.0 mmol/L)显著抑制(P0.04)肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中NaP-Ⅱb mRNA表达,显著促进(P0.0001)细胞中PiT-2 mRNA表达,而对PiT-1 mRNA表达及NaP-Ⅱb、PiT-1、PiT-2蛋白的表达没有显著影响(P0.15);3)孵育液中添加磷(48.0 mmol/L)显著抑制(P0.04)肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中NaP-Ⅱb、PiT-1的mRNA和蛋白表达,显著促进(P0.0001)细胞中PiT-2 mRNA的表达,而对PiT-2蛋白的表达没有显著影响(P0.15)。以上结果表明,原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞对无机磷的吸收符合饱和载体转运加非饱和扩散模型。并且,当孵育液中磷添加过量时,原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞通过降低NaP-Ⅱb和PiT-1的mRNA及蛋白的表达而限制对磷的吸收。综上所述,细胞密度约为3×10~6个/mL,在细胞培养的48 h,成功构建原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的物质吸收模型;无机磷在原代培养十二指肠上皮细胞中的磷吸收方式以非饱和扩散加饱和载体转运为主;当孵育液中磷添加过量时,细胞通过下调NaP-IIb、PiT-1 mRNA和蛋白表达水平及上调PiT-2 mRNA的表达,而限制对磷的吸收,这可能是细胞为了避免磷吸收过量而中毒的自我反馈调节机制。
【图文】：

机制,磷酸根,载体,细胞膜

从空转运体的重定位（8-1）获得电性，并且在跨膜电场（1-2a）中结合1个Na赖性转运，但是这个过程只转运Na+不转运P；第二阶段是不依赖于电压的转运Na+的转运体在细胞膜上移动，结合第二个Na+，之后诱导磷与该转运体作用结合第三个Na+，此时，该转运载体一共负载三个Na+和一个磷酸根，NaP-II蛋，并实现向细胞内的转运，最终在细胞膜内侧将三个Na+和一个磷酸根释放，a+- Na+-Pi- Na+的先后结合顺序，是逆电中性的过程。NaP-IIc被发现主要在小鼠肾脏对磷的重吸收（Segawa 等，2002）。III 型钠磷协同转运载体包括两种，载体1（Inorganic Phosphate Transporter1，，PiT-1）和无机磷转运载体2（Inorganicter 2，PiT-2），主要在鼠小肠的刷状缘膜和隐窝/绒毛轴上皮细胞以及神经元、，维持细胞磷的转运、及体内磷稳态（Collins 等，2004； Inden 等，2013），1 在十二指肠顶膜上表达（Giral 等，2009）。另外，还在磷诱导的小鼠血管平挥了重要作用（Li 等，2006；Dai 等，2013），并发现PiT-2 也参与在这amel 等，2013）。并且，PiT-1和PiT-2已被证实具有保守性的磷转运功能，参与胞矿化等（B ttger和Pedersen，2005）。III 型钠磷协同转运载体在肠道转运磷（Virkki 等，2007），在先后结合Na+和P时既有序又随机，是一个混合型的合Na+也可以先结合P，最终该转运载体共结合两个Na+和一个磷，从而发生电细胞膜内侧将两个Na+和一个磷酸根释放。

机制,肉仔鸡,十二指肠,饲粮

图1-2 NaP-III转运载体转运磷的机制（Virkki 等，2007）ure 1-2 The transport mechanism of type III sodium-dependent phosphate transporters（Virkki 等钠磷协同转运载体在鸡上的研究已有一些报道。研究表明，NaP-IIb主要在鸡A 表达水平在十二指肠最高（Han 等，2009；Fang 等，2012；刘松柏，20有利于促进肉仔鸡十二指肠NaP-IIb mRNA表达（Liu 等，2016）。Nie 等（20指肠NaP-Ⅱb mRNA表达水平随着饲粮中非植酸磷水平的升高而降低。本实验采用自然饲喂法研究报道，NaP-IIb mRNA主要在肉鸡十二指肠表达，而Pi要在其回肠表达；饲粮低磷水平可促进肉鸡十二指肠NaP-IIb和PiT-1 mRNA 的2 mRNA表达。然而，Bai 等（2000）报道，PiT-2 蛋白在小鼠空肠表达最高。在肉仔鸡小肠中的吸收规律及其分子机制的研究结果表明，十二指肠是肉仔鸡aP-IIb mRNA 表达的主要部位，并且无机磷在肉仔鸡十二指肠中的吸收以饱和（刘松柏，2012；Liu 等，2016），饲粮无机磷可通过上调肉仔鸡十二指肠NaP-I水平并降低PiT-1 蛋白表达水平，而促进肉仔鸡小肠对磷的吸收（Hu 等，20道磷吸收的主要部位是肉鸡等畜禽吸收营养物质的主要场所，其中无机磷在整个小肠均可以被吸收
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S831.5

【参考文献】