貉源和狐源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定及其全基因序列分析

发布时间：2020-06-05 09:51

【摘要】：H9N2亚型流感病毒是目前我国主要的流行的一种低致病性流感病毒,具有宿主范围广,可感染家禽、猪、马等多种哺乳动物,导致宿主生产性能下降及免疫抑制病等。H9N2亚型流感病毒还可能与其他病原共感染导致高死亡率,给养殖业带来巨大的经济损失。同时,H9N2亚型流感病毒具有很强的传播能力,且无需经过中间宿主,即可突破种间屏障感染哺乳动物和人,极大地威胁了公共健康安全。2013年,本实验室从山东省中东部地区有呼吸道症状水貂的肺组织中分离到H9N2亚流感病毒A/mink/Shangdong/F6/2013和A/mink/Shangdong/F10/2013。2015年,本实验室从山东省中东部地区有呼吸道症状水貂的肺组织中分离到株貂源H9N2亚型流感病毒。本实验室于2016年8月在该区表现有呼吸道症状的发病貉子和狐狸种群中分离得到八株流感病毒,经鉴定为H9N2亚型流感病毒,命名为A/Raccoon dog/Shandong/G1/2016,A/Raccoon dog/Shandong/G5/2016,A/Raccoon dog/G7/Shandong/2016,A/Raccoon dog/Shandong/G13/2016,A/Raccoon dog/Shandong/G31/2016,A/Raccoon dog/Shandong/G41/2016,A/Raccoon dog/Shandong/G55/2016,A/Fox/Shandong/G60/2016。根据Genbank公布的H9N2亚型流感病毒的基因序列,分别设计各基因片段的特异性引物,采用RT-PCR方法扩增八株分离毒株的HA、NA、PA、PB1、PB2、NS、NP、M各段基因,并与Gen Bank中流感病毒各基因序列进行了同源性比较和氨基酸编码分析,绘制了8个基因片段的系统发育进化树。同源性分析结果发现,八株分离毒株的8个基因片段的同源性为91.1%~100%。分子遗传进化分析表明,HA基因属了Y280-like分支,M基因属于G1-like分支,NP属于Y439-like分支,NA、NS、PA、PB1基因均属于F/98-like分支,PB2属于Korea-like分支。由此可知,八株分离株的各基因所属分支不具有统一性,可推测出本研究所分离的八株H9N2亚型流感病毒毒株可能是来源于不同亚系,因此该分离流感病毒的毒株可能是重组病毒。进一步分析八株分离毒株的分子生物学特性,通过DNAStar软件推导分离毒株的氨基酸序列,并与参考毒株进行分析比较。氨基酸序列分析结果表明,8株分离株的氨基酸序列同源性为99.3~100%;8株分离毒株HA蛋白的第234位氨基酸均为亮氨酸(Leu),具有SAα-2,6-Gal的受体结合特性;在HA蛋白的裂解位点处氨基酸序列为PSRSSR↓GL,符合低致病性流感病毒的特点;HA蛋白含有8个潜在糖基化位点,与参考毒株相比,8株分离毒株均在218位缺失了一个潜在的糖基化位点,在313位氨基酸处增加了一个潜在的糖基化位点;8株分离毒株PB2蛋白的627位氨基酸位点为赖氨酸(Lys),说明8株毒株具有哺乳动物受体结合特性。本研究证实了貉和狐能够感染H9N2亚型流感病毒,这不仅可能会对皮毛动物养殖业造成危害,因此可能通过狐和貉的感染从而导致饲养人员的感染,存在一定的安全隐患。为了解H9N2亚型流感病毒在狐和貉上的流行以及基因的进化情况,本研究通过对H9N2亚型流感病毒分离株进行全基因组的序列测定与分析,探究分离株各基因片段的来源与遗传变化规律,丰富了H9N2亚型流感病毒的流行数据。
【图文】：

貉源和狐源 H9N2 流感病毒的分离鉴定及其全基因序列分析3.3 貉源和狐源 H9N2 亚型流感病毒各段基因的 RT-PCR 扩增结果分别对八株病毒的 HA、NA、M、NS、NP、PA、PB1、PB2 八个基因片段进行 RT-PCR扩增，结果得到的相应的片段，对应的片段大小分别为 1742bp、1500bp、1468bp、1030bp、888bp、2337bp、2326bp、2229bp，与理论片段大小一致。经 1％琼脂糖凝胶电泳后结果如下图 3～10 所示。

貉源和狐源 H9N2 流感病毒的分离鉴定及其全基因序列分析3.3 貉源和狐源 H9N2 亚型流感病毒各段基因的 RT-PCR 扩增结果分别对八株病毒的 HA、NA、M、NS、NP、PA、PB1、PB2 八个基因片段进行 RT-PCR扩增，结果得到的相应的片段，对应的片段大小分别为 1742bp、1500bp、1468bp、1030bp、888bp、2337bp、2326bp、2229bp，，与理论片段大小一致。经 1％琼脂糖凝胶电泳后结果如下图 3～10 所示。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】

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本文编号：2697871