基于RNA测序研究栀子苷对ox-LDL诱导的RAW264.7来源泡沫细胞的基因表达作用

发布时间：2020-06-05 18:06

【摘要】：随着社会经济的发展和人们生活水平的提高,心脑血管疾病已成为全世界范围内死亡的主要杀手,是人类共同面临的健康问题之一。其高发病率、高复发率、高致残率、高病死率、以及并发症多的特点使得心脑血管疾病是广大公众目前须长期面对和解决的重大问题。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是导致冠心病、脑梗塞、腹主动脉瘤、间歇性跛行以及慢性肾病等疾病的共同病理基础。病理学研究证实AS是一种以炎性细胞浸润、脂质沉积、纤维组织增生为特征的慢性疾病,通常累及全身大、中型弹性动脉和肌性动脉。对AS发病机制的认识有多种理论,包括脂质浸润学说、炎症反应学说、内皮损伤学说、和氧化应激学说等。脂质代谢紊乱作为AS发生发展的重要诱因,具有至关重要的影响,在长期血脂偏高的因素下,各种炎性因子及黏附因子表达增加,单核细胞穿越内皮细胞移行至血管内膜下,转化为巨噬细胞,吞噬大量脂质转变为泡沫细胞。单核巨噬细胞吞噬脂质从而形成泡沫细胞为AS进程中的典型病理学特征。因此减少泡沫细胞的产生,抑制AS发生和发展,是心血管研究领域的热点之一。近些年来,新一代高通量测序技术迎来了突飞猛进的发展,以此为基础,高通量RNA测序技术即RNA-seq也迅速进展。与传统的基因芯片技术比较,RNA-seq能在全基因组范围内使用单碱基分辨率检测及量化转录本,无需使用探针,并能对基因组图谱并未完成的生物物种进行检测,不但分辨率高,且具有信噪比高、应用范围广的优势,正成为基因表达研究的重要实验手段及工具。栀子苷是从我国传统清热解毒类中药栀子中提取的环烯醚萜苷类化合物,目前研究表明,栀子苷具有抗AS作用,与其抗氧化、抗炎、保护内皮细胞、调脂、抑制平滑肌细胞增生等功能相关,但机制尚未十分明确,猜测其可能具有调节泡沫细胞相关基因表达的作用。基于此,我们设计了本次实验,试图从RNA测序角度研究其对泡沫细胞的基因表达作用,探索栀子苷抗AS作用的新机制。目的:基于RNA测序,研究解毒中药栀子的主要活性成分栀子苷,对ox-LDL诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞来源泡沫细胞基因的表达作用。方法:造模:选用RAW264.7细胞,通过ox-LDL诱导形成泡沫细胞模型;细胞毒性检测:用CCK-8法检测不同浓度栀子苷对泡沫细胞的增殖及抑制作用,选出合适的浓度;分组:空白对照组、模型组、小剂量栀子苷组、大剂量栀子苷组;不同浓度栀子苷处理24小时后分别收集细胞,提取RNA,随后进行RNA样品测序,并对差异表达基因进行GO与Pathway富集分析。结果:细胞油红0染色结果:经过80ug/ml ox-LDL处理的RAW264.7来源细胞泡沫化最明显,大部分细胞内侧聚集大量红色脂质颗粒,超过了细胞周长的2/3;CCK-8法结果:栀子苷对RAW264.7来源泡沫细胞无细胞毒性作用;RNA测序结果:与空白对照组比较,模型组有大量异常高表达和低表达的基因。对这些异常的基因进行GO与Pathway富集分析,结果发现这些被改变的基因涉及了多个与AS相关的功能及通路,如与脂质代谢相关通路、MAPK信号通路、TOLL样受体信号通路、血管内皮细胞迁移、平滑肌细胞增殖迁移、PPAR信号通路以及炎症信号通路等;与模型组相比较,发现大、小剂量栀子苷(80μg/ml、30 μg/ml)能改变泡沫细胞中异常高表达或低表达基因,进而调节MAPK信号通路、脂质代谢相关等通路,且大剂量栀子苷在调节MAPK信号通路的同时,能针对泡沫细胞中异常表达的Nr4a1基因和Fos基因进行靶向上调,从而达到抗AS的目的。结论:1.栀子苷可能通过调节MAPK靶信号通路来改善ox-LDL诱导的RAW264.7来源细胞泡沫化。2.栀子苷可能通过调节泡沫细胞中异常表达的Nr4a1基因和Fos基因来达到抗AS的目的。
【图文】：

序列,分析流程,数据分析,测序

图２分析流程图逡逑２．６．２．数据分析结果逡逑２．６．２．１测序序列格式展示逡逑ＮＧＳ邋（Ｎｅｘｔ邋Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，二代高通量测序）如：ｉｌｌｕｍｉｎａ邋Ｈｉｓｅｑ逡逑

均衡性,碱基,均衡分布,测序

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【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54

【参考文献】