荧光假单胞菌2P24中oprF和sigX基因调控抗生素产量的研究
发布时间：2020-06-07 04:41
【摘要】：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)2P24分离自小麦全蚀病自然衰退土壤,对多种植物土传病害具有良好的防效,产生抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphlorlucinol,2,4-DAPG)是其主要的生防机制。本研究利用Tn5转座子筛选到oprF和sigX基因影响抗生素产量并对oprF和sigX调控2,4-DAPG产量的机制进行探索。利用菌株产生红色色素的性状作为筛选靶标,从大约10000个转座突变体中初筛获得8个抗生素产量提高的突变体,编号分别为PM640-PM710,测序表明转座子分别插入到phlF、oprF、ass、nirF、waaQ、vacB、oprL和emhA基因上,其中oprF突变体产量提高最显著。oprF基因编码一个跨膜通道蛋白,卜游是ECF(extracytoplasmic functions)类σ因子基因sigX。利用同源双重组法构建oprF内缺失突变体PM651、sigX内缺失突变体PM652以及双突变体PM653,抗生素产量分析表明PM651(ΔoprF)的2,4-DAPG和中间产物间苯二酚(PG,phloroglucinol)产量提高,而 PM652(ΔsigX)的 2,4-DAPG 和 PG 产量下降。双突变体 PM653(ΔprFΔsigX)与 PM652(ΔsigX)表型趋势一致,而且双突变体中互补SigX后抗生素表型向野生型恢复,但互补OprF基因表型没有恢复。对峙培养试验中各菌株对立枯丝核菌的抑菌效果也与抗生素产量的结果一致。以上结果表明oprF负调控抗生素产量,sigX正调控抗生素产量,并且oprF对抗生素产量的调控依赖sigX基因。温室防病试验结果表明突变体PM651(ΔoprF)和PM652(ΔsigX)防治番茄青枯病能力和根围定殖能力均较野生型显著下降。此外,oprF基因负调控菌株AHL信号的产生,而sigX基因正调控信号产量;oprF和sigX基因均正调控菌株2P24的游动能力和生物膜的形成。多个生防相关性状都受到oprF和sigX基因影响,表明这两个基冈与菌株的环境适应性关系密切。菌株2P24中,在转录和蛋白水平上均证明sigX正调控oprF基因表达,oprF基因负反馈调节sigX的表达。但oprF和sigX突变体中PhlA和PhlD的蛋白表达水平较野生型没有显著变化。由于突变体中PG产量发生改变但PhlD水平没有发生变化,推测是PG的底物量发生了变化。经检测发现sigX突变体PM652中丙二酸单酰辅酶A(malonyl-CoA)水平显著下降,说明sigX正调控malonyl-CoA产量。进一步对乙酰辅酶A羧化酶四个亚基(AccA、AccB、AccC、AccD)的转录和蛋白表达水平检测,accA和aaccC的表达在oprF突变体中显著提高,而在sigX突变体中显著下降。以上研究表明oprF和sigX基因是一类新发现的,通过影响菌株2,4-DAPG的底物供给来改变抗生素的产量。利用表型芯片组(Phenotype Microarray,Biolog,America)系统筛选能够诱导sigX表达的条件,证明低渗透势条件、甘氨酸以及某些抗生素能有效促进sigX的表达。验证试验也证明野生型2P24在低盐和高甘氨酸条件下PG产量提高,而sigX突变体没有显著变化。SigX可以感知环境压力对细胞外膜造成的胁迫,调节抗生素2,4-DAPG的合成,对于抵御其他微生物侵害,快速修复细胞损伤,以及适应不良环境都有重要意义。
【图文】：
中国农业大学博士学位论文逦第－？章绪ｉ（逡逑Ｉ－Ｖ生物型（／！／７ｗｏｒｅｙｃｅｎｓｂｉｏｖａｒ邋Ｉ－Ｖ）邋（Ｓｔａｎｙｅｒｅｔａｌ．，１９９６）。这种方法对突光类假单胞菌的区逡逑分更加细致，但缺点是（、能将月和Ｐ．／ＺｗｏｒｅｓｃＣＴＭ■的这两个相似性较高的种很好的区分。逡逑进步对上述分类方法进行完善和补充，从更多表型、生理、形态、生化等多方而因素考量，逡逑并对其进行赋值后利用公式进行数学运算，从而利用数值分类法的进行分类。例如常用的Ｂｉｏｌｏｇ逡逑ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ邋ｓｙｓｔｅｍ邋（Ｂｉｏｌｏｇ邋Ｈａｙｗａｒｄ，邋ＵＳＡ）就属于这种分类系统。利用这类系统可以将之前的生逡逑物型进步划分为不同的亚组（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）。检测表明荧光假单胞菌的Ｉ、ＩＩ、ＴＩＩ生物型亚组的相逡逑似度较高，而ＩＶ与其他几个生物型亚组差异较大，因此研究人员更倾向于将ＩＶ亚组划分成为种逡逑（Ｊａｎｓｅｅｔａｌ．，，邋１９９２）。但对于区分和？Ｐ．／Ｚｗｏｒａｓ＇ｃｅ似菌株，该方法还是难以奏效。逡逑在利用表型分类技术不断发展的同时，分子生物学的分类手段也对假单胞菌的分类起到了重逡逑要的推动作用。利用ＤＮＡ－ＲＮＡ杂交方法可将假单胞菌划分为５个核糖体同源组，其中己知的荧光逡逑假单胞菌株大多属于核糖体同源组Ｉ邋（Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ，１９７４）。通过对大量菌株进行ＤＮＡ和ＤＮＡ的杂逡逑交表明，不同菌株之间差异较明显。户押似ａ和户．／Ｚｗｏｒｅｓｃｅｍ’基因组ＤＮＡ杂交的一致性不超过５５％，逡逑表明这两个种在核酸水平差异明显，可以通过ＤＮＡ杂交对这两个种的菌株进行区分（Ｌａｇｕｅｒｒｅｅｔ逡逑ａｌ．，１９９４），但该方法花费昂贵且耗时，在一般的种类鉴定中并不常用。逡逑／
四个基因负责２，４－ＤＡＰＧ的合成。对冲／双’ＳＺ）的基因丨＞ｉｊ隔区分析衣明，Ｈ有／ＡＭ基因逡逑上游有启动子区域，启动子截断实验Ｈｉ证明由同个动子拧制转录，所以是逡逑作为？个转？＾申．兀进行转４友达的（ＢａｎｇｅｒａａｎｄＴｈｏｍａｓｈｏｗ，邋１９９９）0逡逑ＰｈｌＤ蛋白作为ＩＩＩ型聚酮合酶（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅｓ，邋ＰＫＳｓ）家族中的一货，其氨基酸序列在逡逑２，４－ＤＡＰＧ产生菌中极为保守，ＰｈｌＤｌｉｉＭ２，４－ＤＡＰＧ合成途抒中的限速酶（Ｐｉｃａｒｄａｎｄ邋Ｂｏｓｃｏ，２００３）。逡逑对ＰｈｌＤ的功能解析表明，ＰｈｌＤ有底物专一性，只有丙二酰单酸辅酶Ａ邋（ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ）作为底物时，逡逑ＰｈｌＤ才表现酰雄转移酶活性（Ａｃｈｋａｒｅｔａｌ．，２００５）。在ＰｈｌＤ的催化卜＿３分子的ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ通过聚逡逑酮缩合过程产生３，５－庚—酮乙醋（３，５－出１如0１＾１３１＾（１丨（＾），进而环化脱竣形成间苯二盼（六￡；１１１（３＾逡逑ａｌ．，邋２００５）。如图１－４所示２，４－ＤＡＰＧ的合成途径中，ＰＧ作为２，４－ＤＡＰＧ的直接前体，其合成过积和逡逑产虽直接影响了抗生素２，４－ＤＡＰＧ的最终产量。逡逑ＰｈｌＡ、ＰｈｌＢ、ＰｈＩＣ蛋白均具Q圂；泼富钚越峁褂颍诙鲵堪椎墓餐饔貌罚来卧诩溴义媳饺颖交返牧礁隽谖灰阴；屑洳锏ヒ阴；浔饺樱ǎ恚铮睿铮幔悖澹簦欤穑瑁欤铮颍铮纾欤酰悖椋睿铮欤义希停粒校牵┖椭詹铮玻矗А挂阴当椒樱ǎ玻矗模粒校牵６裕玻矗模粒校堑暮铣衫此担饈瑁ǎ浚刀觯咤义先保坎诲澹撸恕＃校瑁欤铃宓柏祝坑桑渝澹族灞嗦氲囊桓鲥澹桑桑慑搴ヵ＃粒缅澹绣搴铣赡穑ǎ
本文编号：2700861
【图文】：
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四个基因负责２，４－ＤＡＰＧ的合成。对冲／双’ＳＺ）的基因丨＞ｉｊ隔区分析衣明，Ｈ有／ＡＭ基因逡逑上游有启动子区域，启动子截断实验Ｈｉ证明由同个动子拧制转录，所以是逡逑作为？个转？＾申．兀进行转４友达的（ＢａｎｇｅｒａａｎｄＴｈｏｍａｓｈｏｗ，邋１９９９）0逡逑ＰｈｌＤ蛋白作为ＩＩＩ型聚酮合酶（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅｓ，邋ＰＫＳｓ）家族中的一货，其氨基酸序列在逡逑２，４－ＤＡＰＧ产生菌中极为保守，ＰｈｌＤｌｉｉＭ２，４－ＤＡＰＧ合成途抒中的限速酶（Ｐｉｃａｒｄａｎｄ邋Ｂｏｓｃｏ，２００３）。逡逑对ＰｈｌＤ的功能解析表明，ＰｈｌＤ有底物专一性，只有丙二酰单酸辅酶Ａ邋（ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ）作为底物时，逡逑ＰｈｌＤ才表现酰雄转移酶活性（Ａｃｈｋａｒｅｔａｌ．，２００５）。在ＰｈｌＤ的催化卜＿３分子的ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ通过聚逡逑酮缩合过程产生３，５－庚—酮乙醋（３，５－出１如0１＾１３１＾（１丨（＾），进而环化脱竣形成间苯二盼（六￡；１１１（３＾逡逑ａｌ．，邋２００５）。如图１－４所示２，４－ＤＡＰＧ的合成途径中，ＰＧ作为２，４－ＤＡＰＧ的直接前体，其合成过积和逡逑产虽直接影响了抗生素２，４－ＤＡＰＧ的最终产量。逡逑ＰｈｌＡ、ＰｈｌＢ、ＰｈＩＣ蛋白均具Q圂；泼富钚越峁褂颍诙鲵堪椎墓餐饔貌罚来卧诩溴义媳饺颖交返牧礁隽谖灰阴；屑洳锏ヒ阴；浔饺樱ǎ恚铮睿铮幔悖澹簦欤穑瑁欤铮颍铮纾欤酰悖椋睿铮欤义希停粒校牵┖椭詹铮玻矗А挂阴当椒樱ǎ玻矗模粒校牵６裕玻矗模粒校堑暮铣衫此担饈瑁ǎ浚刀觯咤义先保坎诲澹撸恕＃校瑁欤铃宓柏祝坑桑渝澹族灞嗦氲囊桓鲥澹桑桑慑搴ヵ＃粒缅澹绣搴铣赡穑ǎ
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