猪胃蛋白酶在毕赤酵母中的表达及tRNA丰度对外源基因表达的影响

发布时间：2020-06-07 08:28

【摘要】：猪胃蛋白酶是一种酸性水解酶,在饲料、食品、皮革、医药等方面有着广泛应用。本文将来源于猪的胃蛋白酶基因成功整合到毕赤酵母GS115基因组上,并在毕赤酵母中成功表达。在摇瓶水平下,通过发酵条件优化,猪胃蛋白酶在BMGY-1培养基中扩大培养,在添加甲醇至终浓度为2.5%的BMMY-1培养基中诱导表达,第9 d达到最大酶活2322 IU/mL。产猪胃蛋白酶毕赤酵母菌株10 L发酵罐扩大培养,猪胃蛋白酶酶活最高达到11388 IU/mL,较摇瓶发酵酶活提高了 4.9倍。转运核糖核酸(tRNA)是蛋白质合成过程中重要参与成分之一,为了探索稀有密码子对应的tRNA(稀少tRNA)丰度改变对外源基因表达量的影响,本文构建了毕赤酵母稀少tRNA基因与外源基因共表达体系。首先在GFP基因中添加由4个连续脯氨酸稀有密码子CCG组成的阻遏区,结果显示该GFP基因的表达量明显降低。然后将带有阻遏区的GFP基因和tRNACCGPro基因顺次连接于pPIC9K载体上,在毕赤酵母GS115中共表达,结果使GFP表达量提高了 4.9%;另将带有阻遏区的GFP基因和tRNACCGPro基因分别连接于pPIC9K和pFLDα载体,在毕赤酵母GS115中共表达,GFP表达量最高提高了 12.5%;应用同样方式将tRNACCGPro基因与NFATc3T-GFP融合基因共表达,其表达量提高了 21.3%。可见,tRNACCGPro在毕赤酵母GS115中确为稀少tRNA,通过共表达tRNACCGPro基因可显著提高带有连续该密码子的外源基因表达量,并且,本文构建的共表达体系将同样适用于其他稀少tRNA基因的筛选和验证。同时,验证得到添加tRNA共表达在基本培养基中诱导表达比在丰富培养基中诱导表达优势更加明显。
【图文】：

标准曲线,酪氨酸,标准曲线,酶液

图２－１酪氨酸标准曲线逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ逡逑．５．４待测酶液的制备逡逑各取１邋ｍＬ菌液（同批培养三组平行），１２０００邋ｒ／ｍｉｎ离心５邋ｍｉｎ，取合适体清液，用ｐＨ邋２．０乳酸－乳酸钠缓冲液稀释到一定浓度，使得测定的ＯＺ）２８Ｑ值位曲线之内。逡逑．５．５胃蛋白酶酶活的测定逡逑１）先将酪蛋白溶液放入测定温度４０°Ｃ的水浴锅中，预热５邋ｍｉｎ；逡逑２）操作步骤如下：逡逑离心管Ａ邋（对照组）逦离心管Ｂ邋（实验组）逡逑Ｉ逦Ｉ逡逑Ｖ逦Ｖ逡逑加酶液２５０邋［ｉＬ逦加酶液２５０邋ｆｉＬ逡逑N测定温度水浴２ｍｉｎ逦N测定温度水浴２邋ｍｉｎ逡逑Ｖ逦Ｖ逡逑力口０＿４１１１0１／１：１：０八５００（１］：（摇匀）邋加酪蛋白２５０邋ｐＬ邋（摇匀）逡逑１逦１逡逑

基因序列,密码子,载体,引物

２邋忖料与方；＇ｊ，逦逡逑为了给待验证的伙基因提供对照，构建了包含不能识别密码子ＣＣＧ的逡逑皂的基因的载体ｐＦＬＤｃｃ－ｔＲＮＡ巧Ａ邋（简写ｐｔＲＮＡ二Ａ）。逡逑表２－５实验用引物逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－５邋Ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｕｓｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ逡逑ｙ邋ＰＣＲ逦Ｐｒｉｍｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５’－３’）逡逑ＴＡＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＣＣＧＣ逡逑ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡＴＴ逡逑ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＡＴＴＣＡＣＴ逡逑ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＡＡＴＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＣＴＣＧＧＧ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＧＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＴＡＧＡＡＴＣＡＡＧＡ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＣＧ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＧＣＡＴＣＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＣＧＡＴ逡逑ｙ逦ＡＴＧＴＣＧＡ．ＡＡＧＧＧＧＡＡ邋ＧＡＡ邋—、（；ＦＰ４ＣＣ（；逡逑
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

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