甘草转基因毛状根诱导及培养体系的建立

发布时间：2020-06-07 10:20

【摘要】：甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是豆科甘草属植物,以根茎入药,具有镇痰止咳、补脾益气等作用,是我国传统大宗常用中药材,甘草苷是《中华人民共和国药典》中评价甘草质量的两个指标之一。目前人工栽培甘草中普遍存在甘草苷含量低的问题,不能满足入药标准。揭示甘草苷合成途径关键基因的功能是甘草品质育种的重要前提,通过毛状根培养合成甘草苷也是缓解甘草苷供需矛盾的重要途径。本文将查尔酮异构酶基因通过发根农杆菌介导转入甘草子叶节中诱导毛状根发生,考察了菌株类型、侵染时间、共培养时间等对转化率的影响,测定毛状根鲜重和甘草苷含量,筛选优良单克隆根系;通过基本培养基筛选、pH值处理和YE诱导子处理,以建立高效培养体系。主要研究内容如下:1、甘草CHI-OE毛状根的诱导及鉴定:用发根农杆菌K599、Aqua1侵染甘草子叶节,对侵染时间、共培养时间进行考察,结果表明,发根农杆菌K599诱导率和转化率均优于Aqua1,分别为86.5%、76.2%,农杆菌侵染子叶节的适合时间为20min,侵染后共培养时间为3d,诱导效果最好。与Aqua1相比,K599诱导产生毛状根早1-2d,且根系生长速度快,根系粗壮,分支多。2、优良单克隆根系的筛选:以鲜重和甘草苷为指标,对阳性毛状根进行筛选,结果表明,继代后大部分根系生长缓慢甚至停滞,在生长稳定的根系中筛选到8个根系甘草苷含量优于对照。其中C11根系生长最快,鲜重最高为4.73g,甘草苷含量为0.054%,是对照的2.3倍,而C44根系甘草苷含量最高,为0.059%,为对照的2.6倍。荧光定量结果表明,根系C44和C11中基因的相对表达量较高,分别是对照的19和17倍。3、培养体系的优化:以C44为材料,分析基本培养基、pH值、诱导子浓度及诱导子添加时间对毛状根鲜重和甘草苷产量的影响。结果表明:C44根系在1/2MS液体培养基中生长速率最快,鲜重为4.79g,增殖倍数为15.96倍,甘草苷含量为0.059%;不同pH值下毛状根生长速度和甘草苷积累量不同,pH值为5.8时毛状根中甘草苷含量最高,为0.058%,鲜重为4.91g,增殖倍数为16.37倍;YE浓度和添加时间对毛状根生长速度影响不显著,但在第10d添加0.1mg/mL的YE诱导子,甘草苷含量显著提高,是对照的1.2倍。本研究建立了甘草查尔酮异构酶超表达基因的毛状根诱导体系,筛选了生长速度和甘草苷含量均高于对照的优良毛状根株系,并建立了优良的培养体系,为合成甘草苷以及研究甘草苷代谢相关基因的功能奠定了基础。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.71

【参考文献】