大豆豆血红蛋白还原酶（GmFLbR）基因的图位克隆和功能初步分析

发布时间：2020-06-07 11:42

【摘要】：血红蛋白广泛存在于动物、植物及微生物体内。在植物中,植物血红蛋白在调控根瘤固氮、体细胞胚胎发生和抗逆反应等方面具有重要功能。在大豆(Glycine max L.)中高铁豆血红蛋白还原酶(Ferric leghemoglobin reductase,FLbR)将高铁豆血红蛋白(Ferric leghemoglobin,Lb~(3+))还原为亚铁血红蛋白(Ferrous leghemoglobin,Lb~(2+)),在根瘤固氮中Lb~(2+)对于氮素固定来说是必要条件。通过改善GmFLbR的酶活性,增加Lb~(2+)的含量,从而提高根瘤的固氮能力,将为大豆以及其他农作物提高固氮效率提供更多的基因资源。本文主要研究结果如下:1.通过筛选EMS诱变的大豆突变体库,获得了Glycine max Ferric Leghemoglobin Reductase(Gmflbr)突变体,与野生型Williams82相比,突变体Gmflbr叶片苗期出现红褐色斑点,随着生长发育,斑点数量逐渐增多且叶片变黄脱落;同时,突变体Gmflbr次级根系量、根瘤数量及体积显著降低。叶绿素SPAD值和净光合速率随着植物生长发育逐渐降低,然而,胞间二氧化碳浓度持续显著高于野生型Williams82;2.通过原位杂交分析GmFLbR在叶原基的表达模式,发现该基因在顶端分生组织、侧生叶芽及叶原基均有表达,说明Gm FLbR基因在植物叶发育过程中发挥着重要作用;3.构建GmFLbR的CRISPR/Cas9载体,目前正进行大豆遗传转化工作,预期获得与突变体相同表型转基因植株,进行进一步基因功能的验证;4.筛选EMS诱变的大豆突变体库,通过对叶形突变体msp6214的F2群体进行了图位克隆,将突变基因定位于18号染色体6.02 M-6.55 M区间内;5.通过石蜡切片对突变体msp6214叶片进行观察分析,推测由于木质部、韧皮部、韧皮部纤维及厚角组织的一系列变化,导致叶片近-远轴极性紊乱,从而造成突变体叶片翻卷表型。
【图文】：

通路图,根瘤,低氧,反硝化

大豆豆血红蛋白还原酶（GmFLbR）基因的图位克隆和功能初步分析和 COX将 NO2-还原为 NO，NO随即扩散至细胞基质中，通过 Pgbs 氧化成 NO3-；硝酸盐还原酶（Nitrate reductase, NR）将其还原为 NO2-，，NO2-通过亚硝酸盐转运蛋白（ Nitrite transporter, NiT ）再次运输至线粒体内部，从而形成NO2--NO-NO3--NO2-的循环系统。同时，在类菌体内同样进行着相似的氧化还原反应。NADH-对苯二酚氧化还原酶（NADH-quinol Oxidoreductase, DH）氧化NADH，产生的电子通过 Cyt c 实现反硝化作用，在不同酶的作用下将 NO3-依次还原成 NO2-、NO和 N2[20]。nsHb通过间接调节植物体内 NO合成水平，使植物适应缺氧等极端环境，此外，nsHb 也有类过氧化物酶活性，通过参与 NO 的生理代谢反应，保护植物在与病菌的相互作用中免受硝化胁迫。

图 2.1 V2 期 Williams82 与 Gmflbr表型比较Figure 2.1 Compare with the phenotype in Williams82 and Gmflbr at V2 stage植株表型；B. 真叶表型Phenotype of entire plant; B. Phenotype of rough leaf当植物细胞发生损伤（细胞膜不完整、破裂）或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，染料进入细胞后，结合解体的 DNA，变蓝区域即为坏死细胞，着色程度可以指示植物组织细胞的坏死程度；同时，活细胞的细胞膜完整，能够阻止染料进入细胞内部，因此，完整的细胞不为台盼蓝所染色。在 V3时期，取倒数第二对三出复叶的中间叶片拍照对比并进行台盼蓝染色。图 2.2A 为台盼蓝染色前，野生型与突变体叶片对比，野生型 Williams82 叶色均
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院东北地理与农业生态研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S565.1

【参考文献】