高产葡萄糖氧化酶分泌型基因工程菌的构建

发布时间：2020-06-07 18:45

【摘要】：本实验起始菌株为实验室已经构建的菌株13#菌株,该菌株中的GOD基因是使用了 DNA shuffling技术改造后的,其中有三个氨基酸序列发生了突变(D195G,T357A,L368P)。实验过程中为提高菌株产酶的能力,分步进行了几个阶段的探索研究:第一阶段:在破胞后对胞内蛋白进行蛋白电泳发现胞内仍存在一部分目的蛋白未分泌出来,在蛋白表达分泌的角度对目的菌株进行了改造,分别在转运,折叠,以及转录调控对菌株进行了改造。在pGAPZB载体上插入了转运因子SEC56,发酵结果显示在表达了转运因子后目的蛋白的表达量未得到提高;在pGAPZB分别插入了 CNE1,BDP和PDI三个折叠修饰因子,其中BIP基因的表达使得目的蛋白的表达量得到了提高;在pGAPZB载体上插入了转录调控因子HAC1和THR,发酵结果在表达了HAC1转录调控因子的菌株目的蛋白表达有提高。第二阶段:对上罐发酵的盐离子培养基的浓度进行了简单的优化,在BSM培养基离子浓度为0.5时显示其菌体生长最好,酶活由364 U/ml提升到了 446 U/ml。在表达了 BIP基因后的菌株的3L盐离子培养基培养发酵最终测定粗发酵液的酶蛋白活性为530 U/ml,从粗发酵液的酶的活力来看酶的产量提高了 18%;同样进行盐离子培养基发酵的结果显示表达了转录调控因子HAC1的菌株最终发酵液酶活达到了 600 U/ml,酶的产量提升了 30%多;在之后的工作中对酶活最高的菌株HAC1进行了进一步的探究,在HAC1菌株中表达了来源于透明颤菌的血红蛋白基因vgb,测定粗发酵液的活性结果酶蛋白的活性达到了 630 U/ml,该阶段vgb蛋白的表达小弧度的提高了目的蛋白的表达,而该阶段菌体的生长后期低于对照菌株。第三阶段:对不同来源的基因的表达进行了对比,将突变后的黑曲霉来源的GOD和尼奇青霉来源的GOX进行密码子优化后进行了表达。发酵数据显示同一基因来源的基因GOD,密码子偏好性优化之后进行的表达的菌株酶蛋白活性为540 U/ml,未进行密码子偏好性优化过进行的表达的菌株的酶蛋白活性为446 U/ml;不同来源的基因优化过在同一表达体系中的表达量也纯在差异,GOX的在菌株中最后的表达酶蛋白活性为640 U/ml,而GOD的酶蛋白活性为540 U/ml。经镍柱纯化后经过超微量分光光度计和蛋白电泳的验证,结果显示GOX来源的基因在最终蛋白表达量为1.32 g/L,GOD的量有1.17 g/L低于GOX的表达量。
【图文】：

Ｍｅｔｈａｎｏｆ邋ｑｓ逦ｍＲＮＡ邋ＡＯＸ１逡逑图１－２不同ＲＯＬ基因拷贝数对应甲醇消耗的速率逡逑Ｆｉｇ，ｌ－２邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＲＯＬ邋ｇｅｎｅ邋ｃｏｐｙ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋ｍｅｔｈａｎｏｌ邋ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ逡逑值得注意的是，尽管ＲＯＬ的ｍＲＮＡ达到ＲＯＬ四拷贝以上的水平，但随着拷贝逡逑数从４增加到１５，目的蛋白的表达水平降低，因此也指出了邋ＲＯＬ基因在该表达系统逡逑中的限制条件，图１－１为Ｅｌｅｎａ邋ＣＡｍａｒａｙａｎ研宄中转录量酶活和拷贝数之间的关系。逡逑Ｓ０００邋＝逦ｒ邋２逡逑。—＾＾屋．．．．．．．．．ｒ．．．．．．．．．．．．．１0逡逑ＯＣ逦１Ｃ逦２Ｃ逦４Ｃ逦８Ｃ逦１５Ｃ逡逑＿＿邋￡ｘｔｒａｃｅ８ｕｌａｒ邋Ｈｐａｓｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ＭＨＨ邋ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｉｐａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ逦ｍＲＮＡ邋ＲＯＬ邋—？—ｍＲＮＡ邋ＲＯｔ邋ｎｏｒｍａｌｓｊｅｄ逡逑图１－３不同ＲＯＬ基因拷贝数基因转录效率逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＲＯＬ邋ｇｅｎｅ邋ｃｏｐｙ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｇｅｎｅ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ逡逑而很多文章显示不同的基因在毕赤酵母中的最佳拷贝数依然还不是很清楚，在不逡逑同的基因的表达中有高拷贝显示出了高目的蛋白的表达，而很多高拷贝的基因则表现逡逑出了更低量的表达。逡逑当基因的拷贝数超过某个阈值时基因剂量增加经常导致生产力降低和对细胞生逡逑长的严重负面影响

２．邋２构建强转运因子工程菌逡逑实验的出发点：蛋白的表达过程需要经历在表达系统中的转录，，翻译，折叠修饰，逡逑转运最后被分泌到细胞外，图２－１为外源分泌蛋白的分泌路径。逡逑泡融入逡逑Ａ邋芽泡逦＾逦质膜逡逑0邋0逡逑心Ｊ■核焌逦ＶＪ＇Ｊ逦分泌出胞外逡逑高尔基体逦

本文编号：2701846