兰州熊蜂（膜翅目：蜜蜂科）卵黄原蛋白基因的转录调控

发布时间：2020-06-08 12:43

【摘要】：在生殖过程中,卵黄原蛋白作为卵黄前体,是卵生生物包括昆虫中非常重要的。卵黄原蛋白的转录通常是由激素调控的,比如保幼激素、蜕皮激素及某些神经肽。关于昆虫卵黄原蛋白的转录调控研究主要集中在双翅目与鳞翅目,膜翅目昆虫的卵黄原蛋白转录调控研究较少。兰州熊蜂作为一种重要的授粉昆虫,扩大其繁殖量,产生更多的工蜂后代可更好地满足实际应用中授粉的需求。基于此,研究兰州熊蜂的转录调控具有十分重要的意义。主要结果如下:1、兰州熊蜂卵黄原蛋白基因结构及表达特性兰州熊蜂卵黄原蛋白基因(Genbank号:MF632304)全长为7227bp,包含7个外显子和6个内含子,其mRNA(Genbank号:MF632303)序列长度为5319bp,编码的蛋白长度为1772个氨基酸、分子量201.5 kDa及等电点为6.21。对兰州熊蜂的卵黄原蛋白(BlVg)进行保守域分析,发现其具有典型的卵黄原蛋白结构域:第一,在N端附近的Vitellogenin_N保守域从第28个氨基酸开始,到第750个氨基酸终止;第二,中间部位有保守域DUF1943,自第783个氨基酸起至第1043氨基酸;第三,在C端第1450个氨基酸至第1620个氨基酸为保守域VWD。通过系统进化分析发现,其与其他熊蜂物种位于一个分支上。分别取处女蜂王及产卵蜂王的头、飞行肌、卵巢与脂肪体组织,采用实时荧光定量PCR方法检测BlVg的mRNA表达量。qRT-PCR结果显示,相同生殖状态下的蜂王,在脂肪体中表达量最高(处女王为383.9-倍;产卵蜂王为3357.07倍),飞行肌、头次之,卵巢最低,且不同组织之间均存在显著性差异(p0.05)。在相同组织中,产卵蜂王的BlVg的mRNA表达量显著高于处女蜂王(p0.05)。2、兰州熊蜂转录因子Broad-Complex基因的特征及真核表达兰州熊蜂Broad-Complex基因选择性剪切体众多,通过PCR获得Z1-Z4这四种剪切体,分别命名为BlBrC-Z1、2、BlBrC-Z3和BlBrC-Z4,它们的核苷酸长度分别为1491 bp、1293 bp、1257 bp与1239 bp。兰州熊蜂B1BrC蛋白具有典型的Broad-Complex蛋白应有的保守域:第一,在N端附近的中心区域由BTB保守域及Linker组成;第二,在C端为各种选择性剪切体特异的锌指结构域。通过与兰州熊蜂基因组数据(未发表)比对,发现这四种剪切体在DNA上的排列顺序为Z4、Z3、Z2、Z1。通过荧光定量PCR发现,与处女蜂王相比,产卵蜂王的卵巢中BlBrC-Z1与BlBrC-Z3表达量显著升高。将这四种剪切体构建至pBmFlag-B1BrC重组质粒进行真核表达。通过Western blot证明这四个蛋白均成功表达。3、兰州熊蜂卵黄原蛋白基因BlVg启动子的活性分析采用染色体步移法,以兰州熊蜂腹部DNA为模板,获得卵黄原蛋白基因BlVg起始密码子上游1517 bp长度的5'侧翼序列。生物信息学分析显示,该序列具有TATAbox、CAATbox、C/EBP等基本元件和DBrC3、DE74等响应蜕皮激素信号的重要结合元件。随后构建不同长度的启动子缺失片段,最后利用瞬时转染技术分析该基因启动子的转录活性及调控应答激素的相关元件。结果显示,保幼激素诱导没有显著改变BlVg启动子的活性,而20-羟基蜕皮酮对BlVg启动子活性具有明显的诱导作用。4、转录因子Broad-Complex对BlVg启动子活性的调控作用运用点突变技术,发现启动子上DBrC3结合位点碱基的突变会导致其不能被20-羟基蜕皮酮诱导;此外,将转录因子Broad-Complex与BlVg启动子共转染至Sf9细胞,检测启动子的荧光素酶活性,发现只有BlBrC-Z3转录因子可以提高启动子活性。
【图文】：

蜂的生殖方式逡逑蜂的生殖方式包括两性生殖和孤雌生殖。虽由受精卵发育而来的雌性蜂，但只有蜂王具有产受精卵和未受精卵；而工蜂的生殖系统发，只能产生未受精卵；雄蜂是由未受精卵发熊蜂蜂王产卵的因素逡逑然界的熊蜂蜂群繁育类似，在人工繁育中，蜂越冬或人工滞育的蜂王。因此，越冬蜂王的卵的发展起决定性作用。卵巢发育快的蜂王通常蜂出房也较早，因而，蜂群能够快速扩大。因蜂王产卵的因素达到理想的人工繁育规模。逡逑

有凝胶阻滞分析、ＤＮａｓｅｌ足迹实验和酵母单杂交分析。逡逑凝胶阻滞分析即电泳迁移率变动分析（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ逡逑ＭｏｂｉｌｉｔｙＳｈｉｆｔＡｓｓａｙ，ＥＭＳＡ），其作用原理如图１．２所示。具体原逡逑理如下：蛋白质与末端标记的核酸探针相结合可形成复合物，这逡逑种复合物在电泳时比无蛋白结合的探针泳动的速度慢，即条带位逡逑置相对滞后。该法操作简单、实验过程快速、反应灵敏，，使其已逡逑成为研究启动子转录调控的一项重要方法。Ｋａｙｕｋａｗａ等利用该法逡逑证实家蚕保幼激素ＪＨ诱导的Ｋｒ－ｈｌ直接结合在Ｅ９３启动子上游的逡逑ＫＢＳ位点从而抑制Ｅ９３的转录［４７］0Ｚｈａｎｇ与Ｚｈｅｎｇ通过该法证明逡逑家蚕的几丁质酶５基因的启动子上含有ＢＲ－Ｃ邋Ｚ４顺式调控元件逡逑［４８］。Ｎｉｓｈｉｔａ采用ＥＭＳＡ法发现ＥｃＲ／Ｕｓｐ可与ＢｍＢＲ－Ｃ启动子上逡逑的ＥｃＲＥ－Ｄｂ序列结合［４９］．逡逑白慰是取物逡逑二■取蛋白彶与ｓ敌结合逡逑／逡逑凝寂电泳逦逡逑Ｉ逦鼻——合物逡逑ｆ—Ｔ—逡逑放射自显影逡逑：｜逦逦ｊ逦滞后逡逑１逦逦邋ｆ￣￣￣白结含逡逑ｉｉ—ｉｉｎｉ逦Ｉ逡逑图１．２凝胶阻滞实验原理图逡逑Ｆｉｇ．１．２邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＥＭＳＡ逡逑ＤＮａｓｅｌ足迹实验，可用来检测被特定的转录因子结合的ＤＮＡ逡逑序列所在位置及其核苷酸序列结构。基本原理是当ＤＮＡ分子中的逡逑某一区段与特异的转录因子结合之后便可得到保护而免受ＤＮａｓｅｌ逡逑酶的切割作用，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一逡逑个空白区，俗称为“足迹”。该方法不仅能找到与特异ＤＮＡ结合逡逑的目标蛋白
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士后
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S891

【参考文献】

相关期刊论文 前6条

1 安建东;陈文锋;;中国水果和蔬菜昆虫授粉的经济价值评估[J];昆虫学报;2011年04期

2 徐志洲;梁翠荣;陈海;田md;高向东;;用于蛋白质间相互作用研究的分析技术[J];药学进展;2010年04期

3 黄玉;杨波;迟小华;刘丽宏;李薇;卢学春;;真核生物启动子的研究及应用[J];生物技术通讯;2010年02期

4 魏兆军;洪桂云;姜绍通;鲁成;;家蚕脑核蛋白抽提及其与PTTH基因启动子的凝胶阻滞分析[J];中国农业科学;2008年01期

5 黄家兴;安建东;吴杰;国占宝;;熊蜂为温室茄属作物授粉的优越性[J];中国农学通报;2007年03期

6 刘炜彬;贡成良;薛仁宇;周文林;诸戌娴;曹广力;;家蚕丝蛋白Fhx/P25基因启动子区域的克隆及序列分析[J];动物学研究;2007年01期

本文编号：2703107