microRNA-429通过靶基因SIX1抑制胃癌增殖侵袭

发布时间：2020-06-08 10:45

【摘要】：目的:在中国,胃癌的死亡率很高,仅次于肺癌,是死亡率排名第二的肿瘤。随着胃癌的早期诊断和治疗手段的不断进展,其发病率在发展中国家有所下降,但与其他恶性肿瘤相比,其总体预后仍然不佳。胃癌患者的肿瘤转移和复发仍然是胃癌死亡率居高不下的最主要的原因之一。那么,提高胃癌的早期诊断和晚期胃癌的药物治疗的开发尤为重要。因此,我们需要寻找影响胃癌发展的分子标志物,并进一步研究影响胃癌发展的分子机制及信号通路,减少胃癌的死亡率。SIX1属于同源盒基因SIX家族中的一员,广泛存在于从低等无脊椎动物到人类等许多物种中。SIX1参与到许多组织和器官的发育当中,作为一个人体发育的主要的调节因子,是正常发育必不可少的。作为转录因子,SIX1蛋白能够调控细胞周期进展,还能促进细胞增殖和迁移,并且抑制细胞凋亡。最近的研究表明,SIX1参与了多种肿瘤的发生发展,是一个重要的癌基因,并且与一些肿瘤的预后具有相关性。MicroRNAs(miRNAs)是一类新的内源性非编码的小RNA,大量研究表明miRNA的异常调控在肿瘤的发生发展中起重要作用,包括胃癌在内。miRNA可以调控肿瘤细胞的分化、增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程。miR-429是参与恶性肿瘤发生发展的众多miRNA中的一种。miR-429能够抑制某些肿瘤的生长和侵袭,包括肝癌和前列腺癌。然而,miR-429在人类胃癌中的表达模式如何及其在胃癌发展过程中到底发挥着怎样的作用,目前仍然是未知的。本课题通过检测胃癌组织及癌周正常组织中SIX1的表达,探讨其与临床病理参数和预后的相关性;通过分析细胞周期以及细胞侵袭相关蛋白质,探讨SIX1影响胃癌细胞增殖及侵袭所依赖的分子机制;并通过检测miR-429在胃癌组织及癌周正常组织中的表达情况及其对胃癌细胞增殖和侵袭的影响,分析miR-429的生物学行为以及其潜在的分子机制。方法:本研究应用免疫组化方法检测208例胃癌及癌旁正常组织中SIX1的表达情况。通过RT-PCR以及Western blot法检测胃癌细胞中SIX1基因mRNA及蛋白表达水平;通过细胞生长曲线检测SIX1对胃癌细胞生长与增殖的作用,用基质胶侵袭实验检测SIX1对细胞侵袭的作用。应用Western blot检测SIX1与其他蛋白相互间的作用。同时,我们通过RT-qPCR检测miR-429在胃癌组织及正常胃黏膜组织中的表达水平,通过CCK8实验检测miR-429对胃癌细胞增殖的影响;用基质胶侵袭实验检测miR-429对细胞侵袭的作用,应用Western blot检测miR-429与其他蛋白相互间的作用。我们还构建了miRNA靶基因报告基因检测系统,验证SIX1是否为miR-429直接作用的靶基因。结果:1、SIX1在胃癌组织中过表达:免疫组化显示SIX1蛋白在细胞核和细胞浆中均存在染色,在208例胃癌组织中,49.5%(103/208例)呈SIX1高表达。2、SIX1蛋白表达与胃癌临床病理因素相关性:SIX1的过表达与较高的TNM分期,肿瘤大小(T期)和淋巴结转移具有显著相关性(p0.05)。通过生存曲线和Log-rank检验分析,我们发现SIX1与患者不良预后具有显著相关性。通过Cox多因素回归分析,我们发现T、N分期和复发与患者预后相关,能够独立预测患者的不良预后。3、SIX1促进胃癌细胞增殖、侵袭:通过MTT实验,我们发现SIX1转染增强了SGC-7901胃癌细胞系的增殖,而SIX1特异性siRNA干扰则抑制了HGC-27细胞的增殖。通过Transwell实验,我们发现SIX1转染增强了细胞的侵袭能力,而SIX1特异性siRNA干扰则抑制了细胞的侵袭能力(p0.05)。4、SIX1调控cyclin D1以及MMP2的表达:在SGC-7901细胞系中,SIX1过表达能够显著上调cyclin D1以及MMP2蛋白质的表达量;而在HGC-27细胞系中,SIX1干扰则抑制了这些蛋白质的表达。5、SIX1调控ERK信号通路:SIX1过表达使ERK的磷酸化水平显著上调,而SIX1干扰则使ERK的磷酸化水平显著下调。6、SIX1调控EMT:发现SIX1过表达使胃癌细胞中E-cadherin的水平下调,而SIX1干扰使E-cadherin的水平略微上调。7、miR-429在胃癌组织中表达下降:通过RT-qPCR的方法检测miR-429在15例胃癌组织与对应正常胃组织表达水平,与正常组织相比,miR-429在胃癌组织中表达量降低的有9对。8、miR-429抑制胃癌细胞增殖、侵袭:CCK8实验结果表明:与对照细胞相比,miR-429 mimic转染后细胞增殖能力显著降低,而miR-429抑制剂转染后细胞增殖能力显著高于对照细胞。Transwell实验表明miR-429 mimic转染后的SGC-7901细胞穿过基质胶的数目明显下降,而转染miR-429抑制剂后的SGC-7901细胞穿过基质胶的细胞数量明显增加(p0.05)。9、miR-429在胃癌细胞中能够抑制MMP2的表达量及ERK信号通路:转染miR-429 mimic后MMP2的蛋白表达量显著下降;而转染miR-429抑制剂后MMP2的蛋白表达量升高。上调miR-429可抑制ERK通路,而下调miR-429激活ERK通路。10、SIX1是miR-429在胃癌细胞直接调节的靶基因:Western blot结果表明miR-429在胃癌细胞中可以抑制SIX1蛋白的表达。构建了miRNA靶基因报告基因检测系统,显示SIX1基因的3'端非编码区域是miR-429的直接结合位点。结论:1、SIX1在人类胃癌组织中过量表达。SIX1的过表达与较高的TNM分期,肿瘤大小(T期)和淋巴结转移相关,且与患者不良预后有关。2、SIX1过表达促进胃癌细胞的增殖和侵袭。3、SIX1通过ERK-MMP2介导胃癌细胞侵袭转移。4、miR-429在胃癌中低表达,并能抑制胃癌细胞增殖和侵袭。5、miR-429在胃癌细胞中通过靶基因SIX1调控MMP2抑制细胞的增殖和侵袭。
【图文】：

胃癌,正常组织,胃癌组织,癌组织

中国医科大学博士学位论文3 结果3.1 SIX1 在胃癌组织中过表达我们采用免疫组化方法检测了 SIX1 蛋白在 208 例胃癌组织及癌周非癌组织中的表达（如图 1）。SIX1 蛋白在细胞核和细胞浆中均存在染色。我们发现，，在 208例胃癌组织中，有 49.5%(103/208 例)呈 SIX1 高表达；而在癌周非癌组织中 SIX1呈阴性表达。

患者预后,过表达,风险因素分析,多因素分析

中国医科大学博士学位论文表 2. 胃癌预后风险因素分析：单因素和多因素分析Univariate Multivariate Hazard ratio(95% CI)p value Hazard ratio(95% CI)verexpression 1.803 (1.236-2.631) 0.0022* 1.03 (0.686-1.548) invasion (T) 1.507 (1.212-1.873) 0.0002* 1.413 (1.116-1.789) status (N) 1.708 (1.454-2.006) <0.0001* 1.435 (1.177-1.749) ntiation 0.806 (0.553-1.174) 0.2608 0.846 (0.567-1.260) e 72.793(26.389-200.8)<0.0001* 83.354(28.914-240.290)* 具有显著意义
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

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