水稻miRNAs靶基因验证瞬时表达系统的构建及应用

发布时间：2020-06-08 05:26

【摘要】：MiRNAs是一类内源性非编码小分子RNA,通过剪切靶基因mRNA或抑制蛋白的翻译调控真核生物的基因表达。在植物体内,miRNAs主要参与了生长发育、逆境胁迫反应等多种生物进程。随着测序技术的飞速发展,发现了大量新的miRNAs,miRNA database已经收录了38589个miRNAs,然而大多数miRNA的生物功能及其靶基因仍需要进行进一步的验证。研究miRNA的作用,关键是研究miRNA对靶基因的调控。MiRNAs靶基因的验证常用方法包括Northern Blot,Western Blot,降解组测序(Degradome sequencing),MirTrap,RACE(Rapid amplification of cDNA ends)和荧光素酶报告系统。利用生物信息学预测miRNAs靶基因,采用不同的方法和不同的参数条件都可能会得到不同的靶基因,预测结果存在假阳性和假阴性,因此,对预测的靶基因进行实验验证也是必需的。鉴于miRNA靶基因的实验验证过程较为复杂、耗时,因此,建立一种准确且快速地预测和验证miRNA靶基因的方法对研究miRNA的生物学功能具有非常重要的意义。利用瞬时表达结合荧光素酶报告基因建立的检测系统是靶基因验证的一种快速、简便的方法。本文利用农杆菌所介导的烟草瞬时表达,结合水稻原生质体的瞬时表达,系统研究了不同体系下miRNAs的动态表达,以及靶基因验证的最佳体系。主要结果如下:(1)构建了适用于水稻原生质体瞬时表达的载体,将miR169o过表达载体分别与LUC空白载体,靶基因LOC_Os03g48970.1与LUC的融合载体(后称作LUC-48970)以及LUC-48970m3(及48970突变载体)共转化到水稻原生质体中,miR169o和LUC-48970共转化后的LUC活性显著弱于miR169o和空白融合载体(LUC)共转化,miR169o和LUC-48970m3(即48970的突变)共转化后的LUC活性,表明miR169o可以抑制靶基因LOC_Os03g48970.1的转录表达,而水稻原生质体系统可以用于miRNAs靶基因的检测。(2)在原生质体转化后12h,18h,24h,36h分别检测LUC活性,发现在24h时,LUC的活性最高,表明24h可能是最适宜观察荧光的时期。此外,还利用qRT-PCR检测了这四个时间点成熟miR169o的表达量,整体来看,miR169o的表达量与转化时间具有正相关性,12h表达量最低,在24h表达量上调至十倍。当将miR169o与靶基因融合载体共转化水稻原生质体后,在不同的处理中miR169o的表达具有一定的差异。综合miRNAs表达水平及LUC活性的检测结果,建议在miRNAs靶基因的验证中,水稻原生质体转化后24h-36h作为后续最适宜的检测时间。(3)构建了适用于烟草瞬时表达的载体,将携带miR169o过表达载体与LUC空白载体,LUC-48970融合载体,LUC-48970m3载体的农杆菌分别共注射到烟草叶片中,检测LUC活性,发现miR169o与LUC-48970共表达中的LUC活性明显弱于miR169o与LUC共表达,miR169o与LUC-48970m3共表达中的LUC活性,表明烟草瞬时表达系统可以用于水稻miRNAs的靶基因验证。注射烟草48h,72h,96h检测LUC活性,发现72h LUC活性达到高峰后,又有所降低,表明72h是农杆菌注射后最适宜的检测点。此外,利用qRT-PCR检测了注射后24h,36h,48h,72h成熟miR169o表达量,24h表达量最低,48h时表达量已显著上调,且上调倍数达到近二十倍。综合这两方面的检测结果,建议在miRNAs靶基因验证体系中,烟草注射菌后48h-72h作为后续最适宜的检测时间。(4)利用构建的水稻原生质体瞬时表达系统和烟草瞬时表达系统,检测了mi R812g与其预测靶基因LOC_Os02g07960.4和LOC_Os04g47140.1,miR5076与其预测靶基因LOC_Os02g27594.2,miR818a与其预测靶基因LOC_Os09g36320.1,miR169o与其预测靶基因之间LOC_Os02g53620.1的对应关系,发现除了53620是miR169o的靶基因,其他miRNAs与其预测的靶基因可能不存在剪切或抑制关系。本文通过对miRNAs及荧光素酶报告基因的表达动态分析,建立了水稻miRNAs靶基因的瞬时验证系统,该系统为水稻miRNAs靶基因验证提供了一种简便、快速,且更接近于体内实验的方法,进而为研究miRNAs生物学功能奠定了基础。
【图文】：

1.1 miRNAs 的生物合成过程，摘自 Yu et al., 21.1 the process of miRNAs biogenesis from Yu et学功能小分子 RNA，在植物体内发挥着重要的 分子的切割或抑制翻译来调节植物基因物器官的形态建成，如花（Gao et al., 2响应植物对生物逆境胁迫，主要是病原17）和病毒（Yang et al., 2016）等，以及t al., 2017）、干旱胁迫（陈禹彤等，2015等。因的作用机制基因的方式主要有两种：剪切 mRNA 和同，，与 miRNA 和靶基因的互补程度有关NA特异性切割；如果miRNA与靶基因

过表达 miR169o，会降低水稻对 Xoo 的抗病性（Yu et al., 20o 与其靶基因 48970 的对应关系为参照，来系统研究 miRNAs 的动态表达模瞬时表达的转化采用 PEG 法（Maas et al., 1989; 王华忠等，2007)。PEG主要作用是可以使原生质体的膜电位降低，从而进行凝聚。此外，PEG 还够扰乱并分散于原生质膜表面的蛋白质与脂质的排列方式，进而来提高脂将载体融合到植物的原生质体细胞中，完成转化。原生质体浓度、质粒浓处理时间等都会影响转化效率（Baranski et al., 2007）。原生质体转化中文所采用的各项指标如下：原生质体浓度为 2-5×106个细胞/mL，质粒浓度40% PEG 4000，PEG 处理时间为 15min。该方法的优点是对材料的处理可而可以更直接地研究外源基因在细胞内的瞬时表达。与材料、载体与菌株用的水稻品种是日本晴（Oryza. Sativa L. cv. Nipponbare），所用的大元表达载体 pUC19-nLUC（保存于 E. coli）为实验室所保存，载体图见图
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 陈禹彤;陈华民;余超;Amy Thein;田芳;何晨阳;;水稻miR169o及其靶基因OsNF-YAs对缺水胁迫的早期表达模式[J];生物技术通报;2015年08期

2 王政;方和娣;陈宇;李冠英;谭小力;;甘蓝型油菜BnMKS1基因的克隆、亚细胞定位及其诱导表达[J];江苏农业学报;2013年06期

本文编号：2702609