大豆GmPLMT基因的克隆和功能分析

发布时间：2020-06-09 22:37

【摘要】：磷脂是生命的基础物质,是人类及动植物组织细胞膜的重要组成成分,是人体正常代谢与健康生存不可缺少的物质同时磷脂酰胆碱也是植物生长发育的重要代谢物,也是植物细胞膜主要脂质组分。大豆磷脂酰甲基转移酶(GmPLMT)存在于大豆磷脂酰胆碱合成途径中,是卵磷脂合成的关键酶。为了探明大豆中GmPLMT基因具体功能,为大豆种质的改良提供备选基因,本研究从吉育72号大豆中克隆了得到了GmPLMT基因,构建植物表达载体并进行拟南芥和大豆的遗传转化,获得转基因植株后进行基因表达量及生理生化指标的测定,与非转基因植株的基因表达量生理生化指标共同分析。试验结果表明:(1)通过常规PCR方法,利用NCBI中序列设计特异性引物,成功从吉育72号大豆中成功克隆GmPLMT基因全长cDNA序列,包括完整ORF序列504bp,与NCBI中的GmPLMT序列一致。(2)构建了植物表达载体pCAMBIA3301-GmPLMT,并通过农杆菌介导转化拟南芥和大豆,采用草丁膦除草剂筛选法、PCR鉴定法、southern杂交法共同验证,证明成功获得大量T3代拟南芥和1株T1代转基因大豆,并证明GmPLMT基因以单拷贝形式整合入了大豆和拟南芥基因组中,其中在拟南芥基因组中整合位置不同。(3)利用荧光定量PCR法测定大豆不同生育时期中成熟期的根中的GmPLMT基因表达量最高为0.66是同时期叶片的7.4倍,说明GmPLMT基因在成熟期大豆中主要表达于根部;在大豆种子成熟过程中,每隔5天取一次样品,共采样10次,种子中GmPLMT基因的变化呈先升高后降低的趋势,第一次样品基因表达量为0.061之后逐渐降低至第四次样品的0.004,也是整个大豆成熟过程中的最低值,之后逐渐升高,在第八次达到最大值0.25之后含量迅速降低至0.061,可知GmPLMT基因表达量在大豆种子逐渐成熟过程中呈动态变化;测定大豆种子中磷脂类(磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)、脂肪酸的含量,并通过相关性分析发现不同成熟度大豆种子中GmPLMT基因与磷脂酰胆碱含量呈显著正相关,相关系数为0.5,磷脂酰胆碱含量与亚油酸、亚麻酸均呈显著正相关,相关系数分别为0.74和0.82,可见GmPLMT基因的表达量提高能够直接的增加大豆种子中磷脂酰胆碱和脂肪含量,间接提高大豆种子中多不饱和脂肪酸的含量。(4)利用荧光定量PCR法测定转基因T3代拟南芥不同生育时期GmPLMT基因的表达量,开花期GmPLMT基因表达量最高达到了0.139,成熟期最低为0.054,仅为开花期的38.8%,可见转基因T3代拟南芥中开花期基因表达量最高。多种生化方法测定转基因拟南芥种子中磷脂类、脂肪酸的含量、粗脂肪含量,与野生型拟南芥种子对照中看出,转基因拟南芥中总磷质,磷脂酰胆碱,磷脂酰乙醇胺含量大幅度提高分别为2.02倍、2.09倍、1.36倍;亚油酸,亚麻酸的含量均有提高,提高比例分别为4.51%和3.39%。与在大豆中相关性分析结果一致。可见通过转基因提高GmPLMT基因的表达量不仅能够大幅度提高磷脂酰胆碱及总磷质含量同时能够提高植物种子内多不饱和脂肪酸的含量。
【图文】：

琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖,反转录,并用

Tab.2-8：Digestion of recombinant plasmidsMT 基因的克隆总 RNA 的提取提取到大豆叶片的总 RNA，并用 NANO DROP 2000 测.02。用 1%的琼脂糖变性胶电泳，三条带清晰，证明总于后续反转录以及 RT-PCR 实验(见图 2.1)。

菌液,质粒,重组质粒

GmPLMT重组质粒验证M：DL2000DNAmarker；1：质粒PCR；2：菌液PCR；3：质粒双酶切Fig.2.3GmPLMTrecombinantplasmidvalidationM：DL2000DNAmarker；1：RecombinantplasmidPCR；
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S565.1

【参考文献】