Hr基因功能及豫医无毛小鼠皮肤差异蛋白质组学的初步研究

发布时间：2020-06-10 15:30

【摘要】：研究背景:无毛基因(Hr)是Jumonji家族中的成员之一,定位于14号染色体上的D_2区,在染色体上跨越14 kb,包含20个外显子和18个内含子,主要编码1182个氨基酸,基因长度为19486 bp,其表达产物为约127 kDa的无毛蛋白(hairless protein,HR)。HR功能的缺失可引起毛囊解体,外根鞘细胞凋亡数目显著增多,导致大部分外根鞘结构被破坏,扰乱毛发的正常生长周期,使新毛发的形成受阻。目前对Hr基因的相关研究较少,我们不能断定它的确切功能,但是Hr基因突变能够导致昆明小鼠毛发脱落并保持终身无毛状态,因此豫医无毛小鼠可以作为我们研究毛发生长调控机制的模型。目的:探索Hr基因的基因功能。研究Hr基因突变对昆明小鼠皮肤中分子机制的影响,探究豫医无毛小鼠表型发生变化的原因。研究方法:(1)构建Hr基因过表达载体,将构建成功的过表达载体通过脂质体转染的方式转染进小鼠成纤维细胞(NIH3T3)中,利用Western Blot研究转染后细胞内HR蛋白的过表达效果,通过流式细胞术研究转染后细胞的增殖和凋亡情况,。(2)RNA干扰实验:体外合成siRNA,将siRNA转染进小鼠成纤维细胞(NIH3T3),利用Western Blot研究转染后细胞内HR蛋白的表达效果,通过流式细胞术研究RNA干扰组细胞增殖和凋亡情况。(3)差异蛋白质组学:通过双向电泳及生物质谱技术筛选2月龄和6月龄野生昆明小鼠和豫医无毛小鼠皮肤中差异表达的蛋白,并对这些差异蛋白进行GO和KEGG分析,利用Western Blot对蛋白组学检测结果进行验证。结果:(1)pEGFP-Hr-M和pEGFP-Hr-N重组载体构建成功,经脂质体转染进入小鼠成纤维细胞后,HR蛋白表达量显著提高,但是对细胞的增殖和凋亡没有显著影响。(2)将四组特异的siRNA导入细胞后,HR蛋白表达量均降低,其中第二组siRNA靶点效果最好,但是对细胞的增殖和凋亡没有显著影响。(3)通过凝胶双向电泳检测得到的电泳图谱,找到其中存在差异表达的蛋白点有850个,选出其中差异较大的部分蛋白点做质谱鉴定,鉴定成功的蛋白点有26个。(4)对鉴定出来的26个点进行GO分析,对这些蛋白质的生物学进程进行分析,发现它们主要参与细胞进程:15%;单一的生物过程:14%;应激:12%;代谢过程:12%;细胞组分:9%;多细胞的生物过程:8%;发展过程:8%。从细胞组分来分析,有24%的差异蛋白被定位于细胞内,22%被定位于细胞器中,19%被定位于细胞外,11%被定位于大分子复合物中,其它还有少部分被定位于膜上、膜蛋白等处。根据分子功能分类,这些蛋白有50%具有结合作用,22%具有催化活性,10%具有结构分子活性,剩下的部分分别具有分子功能调节作用、抗氧化活性、分子转导活性和电子载体活性。(5)对这些差异点进行KEGG分析,结果显示差异基因主要分布在雌激素信号转导通路、抗原的处理与表达、内质网蛋白的加工和程序性坏死通路。(6)对其中的两个与皮肤和毛发相关的差异蛋白:角蛋白17(KRT17)和Ⅲ型胶原蛋白(COL3A1)进行验证,结果与双向电泳结果一致。豫医无毛小鼠2月龄和6月龄皮肤中的KRT17表达量确实高于野生昆明小鼠2月龄和6月龄的皮肤。豫医无毛小鼠2月龄的皮肤中COL3A1高于同时期的野生昆明小鼠,但是其6月龄小鼠皮肤中COL3A1低于同时期的野生昆明小鼠。结论:(1)Hr基因过表达和敲低均不会影响小鼠成纤维细胞(NIH3T3)的增殖和凋亡。(2)双向电泳检测出的差异蛋白有850个,然后选取部分点经过生物质谱分析和生物信息学分析,找出了26个差异蛋白,这些差异蛋白主要集中在雌激素信号转导通路、抗原的处理与表达、内质网蛋白的加工和程序性坏死相关通路,Hr基因的突变影响了小鼠体内的相关通路。(3)Hr基因突变上调了KRT17的表达量,KRT17表达量的增加导致了无毛小鼠的皮肤状态发生变化。Hr基因的突变也影响了胶原蛋白的表达,使得COL3A1在2月龄豫医无毛小鼠皮肤中的表达量升高,但是其在6月龄豫医无毛小鼠皮肤中的表达量降低,导致皮肤衰老等一系列变化。
【图文】：

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因在小鼠 14号染色体f hairless genes in mous无毛蛋白（ hairless位区（ nuclear matr localization signal，2）[8]。无毛蛋白的功有一个锌指结构，编化[9-11]。HR功能的大部分外根鞘结构破]。通过病理学实验观整的毛囊结构，而是不能上移，毛发生长控毛发生长发育周

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图 1.1 无毛基因在小鼠 14号染色体的位置Figure 1.1 Location of hairless genes in mouse chromosome 14无毛基因的表达产物被称为无毛蛋白（ hairless protein， HR），含有四个常重要的结构域，为核基质定位区（ nuclear matrix targeting signal，TS）、核定位序列（ nuclear localization signal，， NLS）、富含半胱氨酸锌结构域和 JmjC结构域（图 1.2）[8]。无毛蛋白的功能目前仍然不是很清楚，是有数据显示，无毛基因部位有一个锌指结构，编码着高表达于脑部和皮肤的转录因子，表达呈周期性变化[9-11]。HR功能的缺失可引起毛囊解体，外细胞凋亡数目显著增多，导致大部分外根鞘结构破坏，毛发的生长周期不能常运行，新的毛发形成受阻[5]。通过病理学实验观察皮肤组织切片，研究者现 Hr 基因突变小鼠已没有完整的毛囊结构，而是形成许多囊肿，以后也没新的毛囊形成，真皮乳头滞留不能上移，毛发生长信号中断，毛发不能重新长[8]。可见，Hr 基因功能对调控毛发生长发育周期意义重大。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

【参考文献】