生菜叶片红色调控基因的克隆与功能验证

发布时间：2020-06-10 16:17

【摘要】：生菜叶片通常有红色和绿色两种,红叶生菜因具有独特的颜色、质地和保健功能,越来越受到人们的喜爱。生菜叶片红色的形成是由于花青素的积累,在矮牵牛、拟南芥以及玉米中,花青素合成的分子机理已经有详细的研究,但是生菜中花青素的研究报道相对较少。为了克隆调控生菜叶片红色深浅的基因,本实验室将绿色油麦菜Y37与浅红色生菜S1杂交,杂交后自交创建颜色分离群体,对Y37×S1重组自交系进行遗传分析,发现实验室已经克隆的4个生菜叶片颜色调控基因(3个调控基因RLL1-3和1个结构基因RLL4:ANS)并不能完全解释生菜中叶片颜色的差异,筛选了114个家系,经过表型鉴定,共得到32个叶片颜色存在分离的F_4家系,利用RLL1~4基因相关的分子标记检测,发现Q54家系为四个位点纯合,但是叶色存在分离的群体(叶深红与叶浅红的分离比≈3:1),表明该家系的叶片颜色差异由新的单个叶片颜色基因控制的,利用BSR-Seq的方法,定位该分离群体的叶片颜色控制基因。将25株浅红植株和25株深红植株分别混成一个极端表型池,取相同样品混池提取RNA,进行RNA测序。分析测序数据发现,在9号染色体的63 Mb~69 Mb区域内,等位基因频率具有显著差异,推测控制生菜叶片红色深浅的基因位于此区域内。进一步开发CAPS和SNP分子标记,筛选交换单株,最终将候选基因定位在9号染色体的63.898 Mb~64.256 Mb区域内,约357.5 Kb。对该区段的基因注释分析,发现该区段内有三个与花青素相关的基因,进一步比较三个基因在两个亲本中的序列差异和表达量差异,最终将编码WD40蛋白的基因确定为候选基因候选基因,命名为RLL5。在亲本中RLL5基因存在两处碱基的突变,均发生在保守结构域,第402bp(即第134个氨基酸)处单个碱基的突变导致氨基酸发生突变(缬氨酸变成天冬氨酸),使得RLL5基因功能缺失。比较深红色生菜与浅红色生菜叶片花青素合成相关基因的表达量,发现在深红色生菜叶片中,花青素合成相关基因的表达量明显升高,RLL5基因的表达量没有明显差异。对两种颜色的生菜叶片中花青苷类化合物的种类及含量进行测定,显示深红色生菜叶片至少存在19种花青素类化合物,它们的含量均高于浅红色生菜叶片,这使得深红色生菜叶片中花青素的总量增多,显示深红色的表型。通过营养物质含量的比较,发现深红色叶片生菜的品质高于浅红色叶片的生菜。同时,对M9×S1 F_2代分离群体进行遗传分析,发现该群体叶片颜色也存在分离(深红色叶与浅红色叶),而且实验室已经克隆的上述五个生菜叶片颜色调控位点并不能解释M9×S1群体叶片颜色的差异,统计结果显示该群体叶深红与叶浅红的分离比≈3:1,这表明该家系还存在一个新的红色叶片控制基因。同样利用极端混池测序的方法进行分析,发现在1号染色体的69 Mb~213 Mb区域内等位基因频率具有显著差异,我们推断该区域内存在调控生菜叶片红色深浅的位点。通过开发CAPS和SNP分子标记,筛选交换单株,将候选基因定位在73.58 Mb~213 Mb区域内,由于该区段内没有合适的分子标记,只能将基因定位这一区域。克隆生菜中花青素合成相关的基因,将有助于培育花青素含量丰富的生菜,阐明生菜中花青素合成途径以及花青素在生菜中积累的分子机制。
【图文】：

花青素

学功能抗氧化剂，是一种自由基清除剂。一方面另一方面，花青素可以提供质子，与自由体自由基平衡，被自由基氧化的物质也可erres et al 2012，卢立真等 2012)。一些研们生活或工作的环境中存在着很多诱发基就会导致人体的遗传物质发生一定的突变通过阻止肿瘤细胞的生长、增值，，降低一亡，达到抗癌的目的。(Arbuzova et al 200图 1 花青素结构Fig.1 Structure of anthocyanin

花青素,肉桂酸,查尔酮,欧芹

图 2 花青素合成途径Fig.2 Biosynthetic pathwayS of anthocyanin一阶段：合成 4-香豆酰 CoA。苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine ammonialya是苯基丙酸类代谢的关键酶，苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶的作用下消去氨式-肉桂酸，这步反应是初级代谢和次级代谢中关键一步，通过肉桂酸羟化namate 4-hydroxylase, C4H）的作用，转化成为反式-4-香豆酸，下一步在 4-CoA 连接酶的作用下形成 CoA 脂（贾赵东等 1990）。肉桂酸羟化酶是植物 P家族的一员，催化肉桂酸生成 4-香豆酰 CoA。二阶段：合成二羟黄酮醇。3 个丙二酰 CoA 和 4-香豆酰 CoA 在查尔酮合成alcone aynthase, CHS）作用下形成查尔酮。人们对查尔酮合成酶研究比较多在欧芹（Petroselinum crispum）中发现的，随后在拟南芥（Arabidopsisna）、金鱼草（Antirrhinum majus）和矮牵牛（Petunia hybrida）中相继被克
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S636.2

【参考文献】