柠条锦鸡儿CkLEA4-3基因的克隆及功能分析

发布时间：2020-06-11 01:58

【摘要】：在植物整个生命过程中,干旱、土壤盐碱化和冻害等成为制约植物生长发育的重要逆境因子;然而经过漫长的演化,植物进化出各种不同的生理生化机制,以适应不同的环境。胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白)是植物在遭遇逆境时诱导合成的一系列功能蛋白,与植物抗逆功能密切相关。豆科灌木柠条锦鸡儿耐干旱、冷、盐碱和瘠薄,是北方干旱荒漠区造林的优势树种。本文从柠条锦鸡儿中克隆得到一个LEA基因,并对其在胁迫响应中所发挥的功能进行了初步研究,具体结果如下:1、该基因cDNA长为971 bp,开放阅读框架长为636 bp,编码211个氨基酸,推测蛋白分子量为22.44 kD,等电点为5.76,是一种亲水蛋白,该基因有31个磷酸化位点以及6个糖基化位点。经氨基酸序列比对与系统进化分析显示,该蛋白没有特定结构域,与拟南芥LEA4(AT5G44310)同源性最近,因此将该基因命名为CkLEA4-3。2、通过实时荧光定量PCR对CkLEA4-3基因的表达模式进行了检测,结果显示CkLEA4-3基因在根、茎、叶中均有表达,并能够受干旱、脱水、ABA、冷、热、高盐胁迫等处理的诱导,这表明该基因可能与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫机制密切相关。3、构建了过表达载体CkLEA4-3-HA,并且转化到野生型拟南芥中,获得的转基因纯合体株系经实时荧光定量RT-PCR检测证明CkLEA4-3基因发现均有不同程度的超表达。4、在400 mM甘露醇和150 mM NaCl胁迫处理下,CkLEA4-3基因过表达拟南芥的萌发率明显高于野生型;主根长度明显要比野生型长,且过表达株系幼苗在400 mM甘露醇处理下比野生型略大。5、干旱胁迫处理下4周大CkLEA4-3基因过表达拟南芥提高了对干旱的耐受能力,且存活率明显高于野生型;干旱胁迫后过表达植物体内的MDA含量的增高幅度明显低于野生型,叶绿素含量明显高于野生型;4周大CkLEA4-3基因过表达拟南芥的失水率低于野生型,并且各过表达株系中参与胁迫响应基因的表达上调。
【图文】：

灌木,胁迫诱导基因,生态造林,脱水胁迫

这两者之间的结合可以进一步调控 rd29A 基因通过研究拟南芥突变体 aba（ABA-缺乏）和 abi（ABA-不脱水胁迫诱导基因在没有脱落酸累积的条件下也可以被表一步证明了这些胁迫诱导基因并不参与 ABA 的调控过程[10,ABA 依赖型的基因表达调控途径和 ABA 不依赖的基因表彼此作用的联系，共同调控基因的表达，保持细胞内稳态的鸡儿鸡儿属于豆科锦鸡儿属植物，分布于中国西北干旱荒漠地布，是黄土高原人工植被建设的主要优良灌木植物，也是造林的先锋植物[82,98]，柠条锦鸡儿抗旱、抗冷、耐盐碱和漠地区植树造林的重要树种[45～47]。此外它还是一种具有极灌木[11,12,45,46,99]，柠条锦鸡儿作为一种抗逆性极强同时具有50]，可以应用于生态造林、饲料和工业生产[2,45,46,100]。

技术路线图,技术路线,蛋白

内蒙古农业大学硕士学位论文 9其非生物胁迫抗逆的分子机制方面的研究甚少。LEA 蛋白家族庞大，各族 LEA 蛋白的生理功能也不尽相同，尽管大部分的 LEA 蛋白被证实具有提高植物抗逆的能力，，但是 LEA 蛋白尤其是非典型的 LEA 蛋白是否还具有其它的分子功能，还有待于进一步的研究[47]。本文从本实验室已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制性消减杂交(SSH)文库[101]中筛选克隆得到 1 条逆境胁迫相关的 LEA 基因，其编码的 LEA 蛋白为 CkLEA4-3，其中 CkLEA4-3 不具有结构域，是非典型的 LEA 蛋白，关于不具有典型结构域的 LEA基因的报道甚少，本实验研究其在柠条锦鸡儿抵抗非生物胁迫中的作用，为提高植物抗逆性功能研究奠定理论基础[47]。1.5 技术路线本实验的技术路线见图 2。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2

【参考文献】