冬小麦miR5049-3p和miR1120a分别与其靶基因6PGL和FBA互作响应低温胁迫的分子机制

发布时间：2020-06-11 02:06

【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一类内源、长度为22nt左右,在多种真核生物中调控基因表达的非编码小RNA。在植物中,它参与了许多生物过程,包括植物的生长、发育及生物与非生物胁迫(包括病害,寒冷,高盐,干旱等)响应。小麦是人们主要的粮食作物之一,在世界各地均能生产。寒胁迫对小麦等经济作物的生长发育及产量有极负面的影响。东北农业大学自主培育出了能克服黑龙江地区高寒气候条件的强耐寒品种“东农冬麦1号”(Dn1)(返青率高达85%),有着重要抗寒相关miRNA资源。从miRNA方向研究其寒胁迫下的糖代谢应答机制,对于丰富小麦抗寒理论、培育抗寒品种具有重要的理论和实践意义。本研究以大田自然降温条件下种植Dn1为基础材料,探讨低温对小麦糖代谢相关miRNA即tae-miR5049-3p、tae-miR1120a,及其靶基因6PGL和FBA表达模式的影响。使用花序侵染法,将pre-tae-miR5049-3p转化到野生型拟南芥(哥伦比亚型)中。验证拟南芥中tae-miR5049-3p及其靶基因的表达模式,并检测拟南芥的生理指标。得到以下主要结果:(1)在自然降温的四个温度区(5℃,0℃,-10℃,-25℃)下,Dn1的tae-miR5049-3p和tae-miRNA1120a表达模式为:分蘖节:随着温度降低,miR5049-3p的表达量呈先升高后降低的变化规律,而miR1120a的表达量则呈“升-降-升”的变化规律,二者均在0℃时相对表达量最高;叶片中:随着温度降低,miR5049-3p呈“先升后降”的趋势,-10℃表达量最高,5℃时相对表达最低;miR1120a则随着温度的降低表达量逐渐升高(-25℃达到最高)。靶基因:6PGL和FBA分别与其对应的tae-miR5049-3p和tae-miRNA1120a呈负调控表达关系。(2)生物信息学分析结果初步揭示了6PGL和FBA基因编码的蛋白的结构,得知1)6PGL和FBA所编码的蛋白分别具有其典型结构域;其中6PGL的氨基酸序列中含有SugarP_isomerase superfamily结构域,该结构域是典型的磷酸糖异构酶家族结构域,而磷酸糖异构酶家族就包含6PGL。而FBA蛋白质则具有典型的ICL_KPHMT superfamily结构域是果糖二磷酸醛缩酶域结构。2)6PGL和FBA蛋白可能分别定位于叶绿体和细胞质且为非分泌型蛋白。3)6PGL蛋白主要以多种空间结构组合而成;而FBA蛋白的3D结构主要以螺旋为主。(3)利用花序侵染法成功转染拟南芥,获得ox-pre-miR5049-3p转基因阳性植株(T3代)。对其进行4℃低温胁迫24 h处理后,检测miR5049-3p及其靶基因6PGL的表达,显示两者负向调控;同时,检测其转基因植株的生理指标(叶绿素含量,伤害率,MDA含量),表明ox-pre-miR5049-3p转基因植株的抗寒性高于野生型。通过RT-PCR及过表达植株验证,本研究证实了低温胁迫下,tae-miR5049-3p能通过降低自身表达量负向调控6PGL的表达量升高,从而介导糖代谢途径提高植株抗寒性。本研究初步揭示了miRNA调控Dn1糖代谢响应冷胁迫的机制,对于强抗寒冬小麦新品种的分子育种,具有重要的理论意义和应用前景。
【图文】：

与分析控糖代谢的抗寒相关 miRNAs 及其靶基因的表达模 的总 RNA 提取及反转录 所示，用 1%琼脂糖凝胶检测的提取 5℃、0℃、-10℃、-25℃下 Dn1 分蘖节。使用超微紫外分光光度计检测 RNA 质量，数据显示每个样品总 RNA 提围内，可以用于接下来的 cDNA 模板合成。通过 miRNA 通用的反转录引 Dn1 样品总 RNA 进行反转录，，分别得到每个样品的 miRNA cDNA 第一

iR5049-3p（A1），miR1120a（A2）成熟体、6PGL（B1）及 FBA（B2）的增产物3-2 PCR products of miR5049-3p ( A1 )、 miR1120a ( A2 )、6PGL（B1）an（B2）表 3-1 扩增 miRNA 及其靶基因的引物序列Table 3-1 Reaction sequence of primers used in qRT-PCR引物名称 引物序列5049-3pF1120aF6PGLF6PGLRFBAFFBARactinFactinR5’-AATATGGATCGGAGGGAGTAC-3’5’-ACATTCTTATATTATGAGACGGAG-3’5’- CTGGAGACGGTTGACTGGAG -3’5’-GGCATCATTGATAGCATACACTTG-3’5’-AAGACGGAGAATGAGGAGAAGG-3’5’-ACGGAGGTAGTAAGCAGGAATG-3’5’-CCTTAGTACCTTCCAACAGATGT-3’5’-CCAGACAACTCGCAACTTAGA-3’结果经数据分析后，得到低温胁迫下 Dn1 分蘖节和叶片中的 miRNAs 及变化情况。结果表明， miR5049-3p 和 miR1120a 在分蘖节和叶片中均有表
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.11

【参考文献】

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本文编号：2707218