miR-514a-3p靶向调控EGFR基因影响肾透明细胞癌生物学行为及机制研究

发布时间：2020-06-11 11:04

【摘要】：目的:研究mi RNA芯片数据库中肾透明细胞癌(cc RCC)组织与癌旁正常组织中mi RNA表达谱的差异,分析mi R-514a-3p在cc RCC组织中的表达情况与临床病理参数之间的相关性。方法:利用在线mi RNA芯片数据库ym500v2中的芯片数据分析496例cc RCC原发肿瘤组织和71例癌旁正常组织中mi RNA表达谱的差异,将fold change3且p0.05设定为显著表达差异;利用实时q RT-PCR法检测20对cc RCC临床组织标本和四种肾癌细胞系中mi R-514a-3p的表达情况;利用独立样本t检验分析揭示mi R-514a-3p的表达变化与cc RCC临床病理参数之间的关系。结果:mi RNA表达谱分析共发现54个mi RNAs在cc RCC组织与癌旁正常组织中存在表达差异,其中27个在肾癌组织中表达显著上调,另外27个显著下调;q RT-PCR结果显示:相比癌旁正常组织或正常肾小管上皮细胞,cc RCC组织或肾癌细胞系中mi R-514a-3p的表达均显著下调(所有p0.01);t检验分析显示cc RCC组织中mi R-514a-3p的表达变化与临床病理参数之间无显著相关性(所有p0.05)。结论:cc RCC组织与癌旁正常组织的mi RNA表达谱具有显著差异,其中以mi R-514a-3p下调最显著,另外mi R-514a-3p在肾癌细胞系中也是显著下调的,然而mi R-514a-3p的表达变化与临床病理参数之间无显著相关性;mi R-514a-3p在cc RCC中有可能扮演抑癌基因的角色。目的:证实肾透明细胞癌(cc RCC)中mi R-514a-3p对靶基因的靶向调控作用及机制。方法:利用在线mi RNA靶基因预测软件筛选出mi R-514a-3p的潜在靶基因;利用实时q RT-PCR检测靶基因m RNA的表达和相关性分析揭示mi R-514a-3p与靶基因表达的相关性;将化学合成的模拟物mi R-514a-3p mimic及抑制剂mi R-514a-3p inhibitor均分别转染到肾癌细胞系中,应用实时q RT-PCR和Western blot检测靶基因m RNA和蛋白的表达变化;构建含靶基因3′-UTR野生型或突变型的双荧光素酶报告基因质粒载体,利用双荧光素酶法检测分析mi R-514a-3p对靶基因的调控方式。结果:在线mi RNA靶基因预测软件筛选出EGFR作为mi R-514a-3p的潜在靶基因。实时q RT-PCR结果显示EGFR m RNA在肾癌组织中的表达显著高于癌旁组织(p0.0001),且相关性分析揭示EGFR的表达与mi R-514a-3p呈显著负相关(p0.05)。相比转染mimic NC或inhibitor NC,转染mi R-514a-3p mimic或mi R-514a-3p inhibitor后肾癌细胞中EGFR m RNA无显著变化(所有p0.05),但是转染mi R-514a-3p mimic后肾癌细胞中蛋白质均显著下调,反之转染mi R-514a-3p inhibitor后EGFR蛋白质表达显著上调。双荧光素酶报告基因实验显示,在转入mi R-514a-3p mimic后,肾癌细胞中野生型EGFR 3′-UTR的荧光素酶活性较对照组明显降低(所有p0.01),而突变型EGFR 3′-UTR无显著影响(所有p0.05),反之,在转入mi R-514a-3p inhibitor后,肾癌细胞中野生型EGFR 3′-UTR的荧光素酶活性较对照组明显升高(所有p0.05),而突变型EGFR 3′-UTR无明显改变(所有p0.05)。结论:在cc RCC组织中,EGFR的表达比癌旁组织显著升高,且与mi R-514a-3p的表达呈负相关;mi R-514a-3p在转录后水平抑制EGFR的翻译,而不是使其裂解;mi R-514a-3p直接靶向调控EGFR的表达。目的:探讨mi R-514a-3p和EGFR对肾癌细胞生物学行为的影响及其机制。方法:将化学合成的小分子抑制剂si-EGFR转染到肾癌细胞,利用集落形成实验及侵袭迁移实验检测EGFR对肾癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响;将化学合成的mi R-514a-3p mimic及mi R-514a-3p inhibitor均分别转染到肾癌细胞中,利用MTS法、集落形成实验及侵袭迁移实验观察肾癌细胞的活力、增殖、侵袭和迁移能力的变化;建立裸鼠肾癌荷瘤模型,定期将化学合成的模拟物mi R-514a-3p agomir或对照注射到肿瘤内,观察肿瘤生长的变化;利用Western blot检测EGFR下游关键信号通路分子表达的变化。结果:相比对照组,转染si-EGFR后肾癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力均显著降低(所有p0.05);转染mi R-514a-3p inhibitor后肾癌细胞的活力、增殖能力、侵袭及迁移能力均比对照组显著升高(所有p0.05),反之,转染mi R-514a-3p mimic后肾癌细胞的活力、增殖能力、侵袭及迁移能力均显著降低(所有p0.05);体内实验结果显示,注射mi R-514a-3p agomir后裸鼠皮下移植瘤的体积和重量显著小于对照组(所有p0.01);Western blot结果显示:相比对照组,转染mi R-514a-3p mimic或inhibitor后,肾癌细胞中AKT、p-AKT及ERK 1/2的表达与对照组均无显著差异,而p-ERK1/2的表达与对照组之间有显著差异,其中转染mi R-514a-3p mimic后肾癌细胞中p-ERK1/2的表达比对照组均显著下调,反之,转染mi R-514a-3p inhibitor后肾癌细胞中p-ERK1/2的表达均显著高于对照组。结论:EGFR可促进肾癌细胞的增殖、侵袭和迁移,而mi R-514a-3p可通过EGFR抑制肾癌细胞的活力、增殖、侵袭及迁移能力;mi R-514a-3p可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长;mi R-514a-3p是通过EGFR/MAPK/ERK通路而不是EGFR/PI3K/AKT通路抑制肾癌的增殖、侵袭和迁移。
【图文】：

ccRCC组织中显著表达差异的miRNAs

肾透明细胞癌与癌旁正常组织
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.11

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本文编号：2707813