PHL和AHP5基因的克隆及其在甜橙和草莓中的功能分析

发布时间：2020-06-14 08:24

【摘要】：果实中糖、酸及其糖酸比的水平是决定果实品质和风味的重要指标,本研究的主要目的是对两个与酸度或糖酸比调节有关的基因PHL(PH-LIKE)和AHP5进行初步的功能验证。PH是从最近的甜瓜分子遗传研究发现的、能够控制果实酸度的基因,该基因在拟南芥中的同源基因编码的蛋白属于生长素输出蛋白家族(PILS),但PH蛋白没有显示出任何转运体活性且相关PH基因沉默的转基因植株并没有和生长素有关的表型,所以PH基因控制果实酸度的生化机制还没有被揭示。本实验室先前构建的甜橙基因共表达网络中,AHP5基因可能与糖酸比调控相关。鉴于草莓的童期比甜橙短很多,为加速研究进程,本研究同时在甜橙(Citrus sinensis)和二倍体草莓(Fragaria vesca)中进行功能的初步验证。由于PH基因所编码的蛋白是与生长素转运相关,使用生长素等激素处理草莓,以确定生长素等激素与草莓PHL基因表达的关系。在甜橙和草莓不同器官及果实发育不同时期分别进行表达量分析,初步验证这两个基因在甜橙和草莓中的表达特征。然后通过基因的超量表达技术和RNAi技术,分别构建植株超量表达载体和RNAi载体。希望通过改变这两个基因在甜橙和草莓的表达为揭示其调控果实酸度和糖酸比的机制提供材料。主要研究结果如下:1、FvPHL基因的表达分析及激素响应草莓中的PHL基因属于一个小的基因家族,家族中共有6个基因命名为FvPHL1~FvPHL6。各基因有着不同的表达模式,FvPHL1/2/6在根、叶、花和果实中的表达差异都不显著;FvPHL3/4/5在一或两个器官中有特异表达,FvPHL4在根和果实中表达量很低,而在叶和花中的表达量相对较高。相反,FvPHL5在根中有较高的表达,在根中的相对表达比在其他器官高十几倍。FvPHL2/3/6在果实中的表达相对较高,尤其是FvPHL3是果实特异表达的基因,在果实的相对表达是根中表达的约180倍,且是花中的4倍。此外,FvPHL各基因表现出果实发育和成熟相关的表达模式。使用不同浓度(0.01、0.1、1和10μM)的IAA处理草莓。结果表明,除了FvPHL2和FvPHL4其他四个FvPHL基因都上调表达。用脱落酸(ABA)、6-苄氨基腺嘌呤(BA)、乙烯利(ACC)、赤霉素(GA3)四种激素处理草莓。结果表明,BA能稍微调节FvPHL3/5/6的表达,ACC、GA_3能调节FvPHL5的表达,而ABA能够影响六个FvPHL基因的表达。外源激素IAA和ABA似乎对发育中的果实FvPHL基因的表达没有影响。2、甜橙和草莓PHL基因、AHP5基因的表达分析应用qRT-PCR对CsPHL1基因、CsAHP5基因在纽荷尔脐橙不同组织以及果实不同发育时期的表达情况进行了分析。CsPHL1基因在纽荷尔脐橙中是普遍表达的基因,该基因在叶片和花中的表达较其他器官高,CsPHL1基因随着果实发育表达量逐渐升高,但变化不是特别明显。CsAHP5基因在纽荷尔脐橙花中的表达量最高,随着果实发育该基因表达量显著升高,在果实成熟期表达量显著高于果实发育其他时期。同样应用qRT-PCR对草莓根、叶、花和果实以及果实不同发育时期如花后10天、15天、20天、25天的表达情况进行分析,FvPHL1在草莓各个器官中都有表达,在根中的表达要比叶和花中高5~10倍,随着果实发育该基因表达量表现出上升的趋势。3、植物表达载体构建、遗传转化及转基因植株的基因表达分析以植物表达载体pFGC5941或其改造载体pFGC5941M为骨架,构建了CsPHL1基因超量表达载体ZZ302和RNAi载体ZZ305;CsAHP5基因超量表达载体ZZ321和RNAi载体ZZ320;FvPHL1基因RNAi载体ZZ312;FvAHP5基因RNAi载体ZZ325及其改造载体ZZ325K。通过遗传转化柑橘和草莓,ZZ302,ZZ305,ZZ321,ZZ325K得到的转基因阳性植株分别为18株,15株,7株,1株。利用qRT-PCR对转基因阳性植株进行表达量分析,CsPHL1基因表达量升高的过表达植株1株,表达量降低的RNAi植株3株。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S666.4;S668.4
【图文】：

柠檬酸,果实,途径,谷氨酸

第 1 章文献综述码的CsCit1蛋白能够介导H+和柠檬酸根离子的电中性共转运参与柑橘果实中柠檬酸从液泡进入细胞质，从而调控液泡缓冲液含量及 pH。柑橘果实中的有机酸主要以柠檬酸为主，柠檬酸的积累主要是发生在果实发育的第二个时期，随着果实逐渐成熟柠檬酸降解，含量逐渐下降。盛玲（2016）总结了植物细胞中柠檬酸的降解主要有两种途径：1、GABA 支路，参与 GABA的合成；2、分解为草酰乙酸（OAA）和乙酰辅酶 A（AcCoA）（图 1-1）。GABA支路是果实柠檬酸降解的一条途径首先被 Cercós 等（2006）研究发现。细胞质中的柠檬酸在顺乌头酸酶 cyt-Aco 作用下生成异柠檬酸，通过异柠檬酸脱氢酶（NADP-IDH）的作用生成 α-酮戊二酸，然后在谷氨酸脱氢酶的作用下生成谷氨酸；谷氨酸是合成 GABA 的前体，通过谷氨酸脱羧酶（GAD）不可逆催化并消耗质子和谷氨酸完成 GABA 的合成。而柠檬酸分解为 OAA 和 AcCoA 是通 ATP-ACL的催化完成。

酸比,子网络,蓝色,果实

日常生活中是重要的消费品。随着近年来人们生活水平的提高，人们对于柑橘果品质的要求也越来越高。柑橘水果中含有丰富的营养物质如糖类、维生素及氧化物等。决定水果甜味和成熟的重要指标是果实的糖酸比，因此果实中的糖有机酸对于果实品质非常重要（Albertini et al.，2006；Etienne et al.，，2013； Osoet al.，2013）。果实中的有机酸主要是柠檬酸和苹果酸，糖类主要有蔗糖、葡萄糖和果糖植物的糖酸代谢过程中的酶早已经被提出，但至今已有编码顺乌头酸酶和苹果脱氢酶的基因被证明其控制果实的酸度（Centeno et al.，2011；Morgan et al.，2013）最近几年研究发现 CmPH基因在甜瓜中能够控制果实的酸度（Cohen et al.，2014）但生理生化机制还是不清楚。本实验室在前期分析了甜橙中纽荷尔脐橙（正常度）、新会橙（正常酸度）、冰糖橙（低酸）、埃及糖橙（无酸）四个品种果实发过程中的糖酸含量变化，并对四种甜橙果实发育第一阶段（花后 45 天，45 DP和果实发育第二阶段（花后 142 天，142 DPA）进行了转录组分析。通过基因共达网络分析，得到 72 个和糖酸比相关的基因，在基因表达网络中这 72 个基因于 4 个模块（Qiao et al.，2017）。

【参考文献】