TBX4基因在肛门直肠畸形大鼠肛门直肠发育过程中的时空表达

发布时间：2020-06-14 13:44

【摘要】：目的:检测TBX4(T-box transcription factor 4)基因在正常和肛门直肠畸形大鼠肛门直肠发育过程中的时空表达,探讨其可能与肛门直肠发育的关系。方法:将Wistar大鼠按雌雄比例5:1晚上合笼过夜,次日晨雌鼠做阴道涂片。在光镜下见到精子即提示交配,当日为孕0天(E0),将孕鼠随机分为两组。ETU组孕鼠于E10时按12.5m L/kg给予1%ETU溶液经灌胃针注入大鼠胃内;对照组孕鼠于E10时按12.5m L/kg给予生理盐水灌胃。对两组大鼠做以下处理:在胚胎发育第13天(E13)至16天(E16)时取材,在10%水合氯醛(4m L/kg)腹腔注射麻醉下,行剖宫术,取出胎鼠,所有标本经0.01MPBS液冲洗。将一部分胚胎置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定72小时,常规脱水,石蜡包埋,制成蜡块,对照组及ETU组的胎鼠正中矢状面连续切片,切片厚度4μm,根据镜下观察进一步分为正常组和ARM组,进行TBX4免疫组织化学染色。其余对照组和ETU组的胎鼠,在显微镜下辨别畸形后进一步分为正常组和ARM组,用Western Blot方法检测正常与ARM组胎鼠直肠组织TBX4蛋白的表达,RT-PCR方法检测正常组与ARM组TBX4 m RNA的表达。结果:免疫组化结果显示:正常组:E13时,TBX4阳性细胞分布于后肠上皮、泌尿生殖窦上皮,特异性阳性染色强度较弱,泄殖腔膜内仅见极少量阳性细胞;E14时,泄殖腔管、后肠上皮内可以观察到较多TBX4阳性细胞,未来肛门开口区域的泄殖腔膜可见大量的阳性细胞,同时,在泌尿生殖窦背侧上皮也可见较多阳性细胞;E15时,直肠、肛膜可见大量的TBX4阳性细胞,尿道上皮上也出现一定量的阳性细胞;E16时,直肠末端上皮和尿道下端背侧上皮也可见TBX4阳性细胞,但数量较E15明显减少。ARM组:E13时,后肠上皮、泄殖腔膜内均未见阳性细胞;E14时,泄殖腔管内可以观察到散在分布的阳性细胞,后肠内仅有接近泄殖腔管处有少量的阳性细胞,背侧泄殖腔膜外层仅有极少量阳性细胞;E15时,直肠尿道之间可见瘘管,TBX4在后肠上皮、瘘管、尿道上皮、背侧泄殖腔膜内表达极弱,特异性阳性染色不明显;E16时,瘘管上皮中可见散在的阳性细胞,直肠末端上皮、尿道下端背侧上皮内仅有零星的阳性细胞。Western Blot结果显示:E13-E16,TBX4蛋白在正常组和ARM组都有表达。E14-E16,ARM组TBX4表达明显减少,尤其在E15时,ARM组TBX4蛋白表达量明显少于正常组(TBX4蛋白:1.25±0.67 vs 2.13±1.01),差异具有统计学意义(P0.05)。RT-PCR结果显示:E13-E16,在正常组和ARM组大鼠胚胎中均能检测出TBX4 m RNA。在正常组,E13-E16 TBX4 m RNA表达量逐渐增高。在E13、E15时,ARM组TBX4 m RNA的表达量明显少于正常组(E13 TBX4 m RNA:0.48±0.18 vs 1.20±0.62,P0.05;E15 TBX4 m RNA:0.96±0.35vs 1.61±0.44,P0.05),差异有统计学意义。结论:TBX4基因在肛门直肠畸形大鼠肛门直肠发育关键时期表达下调可能与肛门直肠畸形的发生有关。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.7
【图文】：

上皮,胎鼠,后肠,畸形类型

中国医科大学硕士学位论文3 结果3.1 大体观察结果正常对照组胎鼠未见畸形发生。用乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)致畸，致畸率约为 80%，畸形胎鼠均为无尾或短尾，畸形类型为直肠尿道瘘和一穴肛，作为ARM 组。3.2 免疫组化结果正常组：E13 时，TBX4 阳性细胞分布于后肠上皮、泌尿生殖窦上皮，特异性阳性染色强度较弱，泄殖腔膜内仅见极少量阳性细胞（图 1a、 2b）。ARM 组：E13 时，后肠上皮、泄殖腔膜内均未见阳性细胞（图 1c、 1d）。

泄殖腔,后肠,背侧,上皮内

中国医科大学硕士学位论文正常组：E14 时，泄殖腔管、后肠上皮内可以观察到较多 TBX4 阳性细胞，未来肛门开口区域的泄殖腔膜可见大量的阳性细胞，同时，在泌尿生殖窦背侧上皮也可见较多的阳性细胞（图 2a、2b）。ARM 组：E14 时，泄殖腔管内可以观察到散在分布的阳性细胞，后肠内仅有接近泄殖腔管处有少量的阳性细胞，背侧泄殖腔膜外层仅有少量阳性细胞（图 2c、2d）。

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