m6A去甲基化酶FTO在Hela细胞中下游基因的筛选及鉴定

发布时间：2020-06-14 14:56

【摘要】：N6-甲基-腺苷(m6A)是真核生物RNA分子最常见和最丰富的修饰之一。m6A修饰过程是动态可逆的,由METTL3,WTAP和METTL14组成的甲基转移酶复合体催化生成,并可在去甲基酶FTO和ALKBH5的作用下被“擦除”。m6A免疫共沉淀高通量测序(Me RIP-Seq)发现,M6A修饰在m RNA的5’UTR、CDS和3’UTR均有分布,但主要集中3’UTR区,特别是在终止密码子附近丰度最高。并且m6A修饰主要发生在DRACH基序(R为G或A,H为A、C或U),其中最常见的基序为GGACU。大量的研究已经表明,m6A通过调节m RNA的结构、剪接、稳定性和翻译效率以及调节micro RNA的加工等方式调节基因的表达,进而参与包括干细胞分化、DNA损伤修复、肿瘤发生等生物学过程。FTO是主要的m6A去甲基化酶基因,该基因通过调节其下游基因特定m6A位点的甲基化水平而调控其下游基因的蛋白水平。目前已经在包括肿瘤在内的多种疾病中发现了FTO基因的异常表达及相应基因组m6A水平的异常变化。但FTO去甲基化功能的下游基因及这些下游基因在不同细胞中m6A修饰的保守性仍不明确。本研究首先通过已公布的FTO基因敲低及过表达后的RNA-seq和m6A-seq数据,筛选8个候选的FTO去甲基化功能下游基因。然后在Hela细胞中敲低及过表达FTO基因,检测FTO敲低和过表达后8个潜在基因的表达变化。结果表明,FTO对C21orf59基因的表达具有正调控作用,而对MZF1,PPARD,KCNG1,RARA和ASB2基因表达具有负调控作用。最后,利用Me-RIP方法检测FTO敲低后各基因特定m6A位点的甲基化水平的变化。结果表明,在6个受FTO调控的下游基因的m RNA上均存在甲基水平显著增加的m6A位点,从而确定该6个基因是FTO去甲基化功能的下游基因。本研究的实施有以下两个方面的意义:(1)为FTO异常表达导致的疾病的发病机制研究提供重要的参考数据。(2)本研究表明m6A对基因的表达具有正调控和负调控两种方式。因此,本研究鉴定的两类下游基因可作为m6A调控基因表达分子机制研究的模型。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78
【图文】：

序列,过程,甲基化,甲基腺嘌呤

遗传学修饰是指在基因组 DNA 序列不改变的情况下，基因功能传的改变，例如 DNA 甲基化、组蛋白乙酰化和 RNA 甲基化等遗传调控在哺乳动物的胚胎发育、分化及疾病的发生方面有着甲基腺嘌呤(m6A)是 mRNA 序列中最常见、最丰富的表观修饰之动态可逆的，由称为编码器的 METTL3, WTAP 和 METTL酶复合体催化生成，并可在称为消码器的去甲基酶 FTO 和被擦除。m6A 修饰在 mRNA 的 5’UTR、CDS 和 3’UTR 均中 3’UTR 区，特别是在终止密码子附近丰度最高（图 1-1）。纪 70 年代被发现，但由于缺乏有效的检测技术和研究手段，其有报道。直到 2011 年，何川课题组的贾桂芳博士发现肥胖相关去甲基酶，揭示 m6A 为可逆的化学修饰，使 m6A 的生物学功能的研究也逐渐成为生命科学领域的研究热点之一。大量的研究已调节 mRNA 的结构、剪接、稳定性和翻译效率以及调节 micro调节基因的表达，进而参与包括干细胞分化、DNA 损伤修复、过程。

循环图,去甲基化,甲基化,循环图

哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 m6A 甲基化的 mRNA 的亲和力比非甲基化 mRNA 的亲和力高 10 到 50 倍[19个 YTH 结构域家族蛋白与 m6A 位点的不同子集相互作用并对基因表达产的作用。例如，第一个鉴定的 m6A 阅读器 YTHDF2 通过促进与衰变因子的来增加 m6A 修饰的 mRNA 的周转[22]。相反，YTHDF1 可以与终止密码子附A 位点结合，然后与翻译起始因子 eIF3 相互作用，从而对哺乳动物的翻译激作用[23]。目前已经有文章显示 YTHDF3 与 YTHDF2 协同作用以加速 mRN，同时它还与 YTHDF1 合作促进甲基化 RNA 的翻译[24, 25]。 YTHDC1 募集子丝氨酸和富含精氨酸的剪接因子 SRSF3 并限制外显子跳跃因子 SRSF10 [26]。hnRNPA2B1 能够通过靶向 m6A 位点招募 DGCR8 成 RNA，表明它在i-miRNA 加工中的重要作用[27]。总之，新出现的新数据和发现揭示了一个A m6A 复杂的图谱，如图 1-2 所示。

【参考文献】