CRISPR-Cas9基因编辑系统在灰盖鬼伞中的应用探究

发布时间：2020-06-14 18:08

【摘要】：灰盖鬼伞是研究子实体发育的常用的模式真菌,目前灰盖鬼伞全基因组测序工作已经完成,但依然有很多预测基因功能是未知的。然而因为同源重组的效率极低,通过同源重组进行基因敲除来研究基因功能的方法在灰盖鬼伞中极为困难。CRISPR-Cas9是由一段非编码的RNA引导Cas9蛋白在识别序列附近切割基因组,产生DNA双链切口(DSBs),DSBs激发细胞的同源重组或非同源末端连接机制修复DNA断裂,从而实现外源基因的靶向插入或内源基因的定向敲除。本文以灰盖鬼伞为研究对象,尝试在灰盖鬼伞中建立CRISPR-Cas9基因编辑系统,来实现对鬼伞中更多基因功能的研究。在真菌转化系统中,用酶酶解真菌细胞细胞壁使其形成原生质体,是准备转化的受体细胞最常用的方法。比如在灰盖鬼伞转化体系中,使用纤维素酶和几丁质酶处理孢子形成原生质体[1]。本实验使用在毕赤酵母中异源表达纯化的、对灰盖鬼伞自溶时有重要作用的几丁质酶ChiⅢ和ChiEn1,代替商品化几丁质酶酶解细胞壁,实验结果表明异源表达的几丁质酶ChiⅢ在等酶活情况下,能够代替商品化的几丁质酶制备原生质体,ChiEn1对ChiⅢ的酶解具有协同作用。本实验室目前灰盖鬼伞转化的筛选仅依赖于营养缺陷型菌株AmutBmut,由于缺少高效的选择标记,还不能对灰盖鬼伞进行双基因或多基因同时敲除。为了更好的利用CRISPR-Cas9基因编辑工具,本实验在灰盖鬼伞中建立了萎锈灵抗性筛选标记,该筛选标记作用浓度低,成本低,并且抗性基因来自于灰盖鬼伞内源基因,在灰盖鬼伞中表达效率很高。本实验尝试在灰盖鬼伞中建立CRISPR-Cas9基因编辑系统,首先我们将表达Cas9蛋白的质粒和sgRNA的质粒转化到灰盖鬼伞中实现基因编辑,但是该方法以能够在鬼伞中找到表达sgRNA的U6(或U3)启动子和成功表达Cas9蛋白的为前提,然而,在鬼伞中表达sgRNA的U6(或者U3)启动子尚未明确,并且实验证明我们获得的Cas9基因在灰盖鬼伞中不表达。因此我们选择使用RNA引导的内切核酸酶(RGENs)来介导灰盖鬼伞的基因编辑。我们将体外表达纯化的Cas9蛋白和体外转录形成的sgRNA结合形成核糖核蛋白复合物(RNPs),再转化到灰盖鬼伞中来实现对基因组基因编辑的目的,但是该方法在体外剪切和体内转化中都没有实现剪切,这可能与Cas9蛋白体外纯化后容易降解、sgRNA转录后极易降解、设计的sgRNA引导剪切活性低等原因有关。我们可以通过多设计几条sgRNA、改善实验无RNA酶环境、或者优化Cas9蛋白序列等方法来改进灰盖鬼伞中CRISPR-Cas9基因编辑系统的研究。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78
【图文】：

图１．２邋ｔｒａｃｒＲＮＡ：邋ｃｒＲＮＡ与靶基因序列和Ｃａｓ９蛋白的结合逡逑Ｆｉｇ邋１．２邋ｔｒａｃｒＲＮＡ：邋ｃｒＲＮＡ邋ｂｉｎｄ邋ｔｏ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｎｄ邋Ｃａｓ９邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑前，在人类细胞［５Ｇ］、小鼠［５１］、斑马鱼［５２］、新杆状线虫［５３］、果蝇［５４］

逦３逦４逡逑图２．２原生质体的制备率。１为商品化纤维素／几丁质混合酶解液组；２为商品化纤维素酶逡逑和与商品化几丁质酶等酶活的Ｃｈｉｌｌｉ混合酶解液组；３为商品化纤维素酶和与商品化几丁逡逑１５逡逑

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本文编号：2713165