小菜蛾肽聚糖识别蛋白PGRP-S2基因的克隆及其微生物结合功能分析

发布时间：2020-06-14 18:34

【摘要】：小菜蛾Plutellaxylostella属于鳞翅目菜蛾科,主要危害青花菜、白菜以及萝卜等十字花科植物的世界性迁飞害虫。肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein,PGRP)作为一种病原微生物识别蛋白,在小菜蛾抵抗病原菌的过程中有着重要的作用。为了探究肽聚糖识别蛋白的作用机理及其表达调控机制,本课题以小菜蛾作为实验材料,克隆鉴定出一条肽聚糖识别蛋白PGRP-S2,并阐明PGRP-S2的作用机理及其表达调控机制,主要的研究成果如下:1.根据小菜蛾的基因组信息,利用RACE技术克隆得到小菜蛾PGRP-S2的开放阅读框序列,通过生物信息学分析得知该序列编码的蛋白含有信号肽、PGRP结构域以及酰胺酶结构域等结构,预示着该蛋白可能存在能够识别和裂解细菌肽聚糖的功能,从而在小菜蛾抵抗病原菌的过程中扮演重要角色。2.利用原核表达系统以及AKTA蛋白纯化系统成功获得目的蛋白PGRP-S2。Western blot分析显示,PGRP-S2蛋白能够与大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus结合;凝集试验结果表明,与对照组相比,经过PGRP-S2蛋白处理的E.coli和S.aureus均出现细胞凝集的现象;抑菌试验结果显示,PGRP-S2蛋白对E.coli和S.aureus并没有直接的抑菌活性。综合上述实验表明PGRP-S2蛋白具有与细菌结合识别的功能,但并没有直接杀死细菌的功能,其作用机理可能是通过与肽聚糖的识别从而激活一系列下游信号途径产生抗菌肽来抵抗病原菌。3.根据小菜蛾基因组信息,利用普通PCR法克隆得到PGRP-S2基因5'侧翼序列 PGRP-S2-P-1937--1。利用 BDGP 分析表明,序列 PGRP-S2-P-1642--1593、PGRP-S2-P-1254--1505、PGRP-S2-P-714--655 以及 PGRP-S2-P-160--111这四个区域可能是转录起始区域;利用Searchfor CARE分析表明,该侧翼序列中包含很多TATA-box以及CAAT-box等真核元件。根据生物信息学分析结果,对侧翼序列PGRP-S2-P-1937--1进行分段克隆并以GFP作为报告基因构建了小菜蛾PGRP-S2基因5'端缺失片段表达载体pET28a-PGRP-S2-P-x-GFP,利用荧光显微镜对侧翼序列进行启动子功能鉴定。结果表明侧翼序列 PGRP-S2-P-1937--1285、PGRP-S2-P-1467--1078以及 PGRP-S2-P-986--518能够启动GFP在大肠杆菌中的表达,具有启动子功能活性;序列-1937～-1492区是Acrorrmyrmex echinatior histone-lysine N-methyltransferase SETMAR的基因编码区,表明PGRP-S2基因5'端-1937～-1285区不是PGRP-S2基因的启动子;荧光强度表明序列PGRP-S2-P-986--518启动子功能活性强于序列PGRP-S2-P-1937--1285,提示PGRP-S2基因的启动子区域可能主要位于-986～-518 bp区域之中。而序列PGRP-S2-P-1937--1、PGRP-S2-P-1467--1、PGRP-S2-P-986--1、PGRP-S2-P-526--1以及PGRP-S2-P-205--1这些区域的启动子功能活性都非常弱,表明在-205～-1 bp区域对PGRP-S2基因启动子的转录调控具有负调控的作用。肽聚糖识别蛋白在小菜蛾抵抗病原微生物的过程中具有重要的作用。利用体外蛋白表达技术以及重组蛋白PGRP-S2与微生物病原菌-大肠杆菌和金黄色葡萄球菌之间互作关系的分析,深入研究肽聚糖识别蛋白PGRP-S2的作用机理;同时结合其5'端侧翼序列缺失片段功能鉴定来研究肽聚糖识别蛋白PGRP-S2的表达调控机制。从小菜蛾抵御病原微生物的免疫系统着手,揭示小菜蛾对细菌侵染的免疫机理,为新型细菌杀虫剂的开发提供了理论基础。
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433.4
【图文】：

氨基酸序列,亲疏水性

蛋白质为水溶性蛋白质。逡逑用Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ对ＰＧＲＰ－Ｓ２氨基酸序列的亲疏水性进行分析，正值表示疏水性，正逡逑值越高表明疏水性越强；负值表示亲水性，负值越低表明亲水性越强。从图１－５可逡逑以看出，该蛋白质的多肽链在第１１３位的氨基酸具有最低值为－２．１７８，亲水性最强；逡逑多肽链在第７位跟第１１位的氨基酸具有最高值为２．７２２，疏水性最强。从整体来看，逡逑整条肽链的大多数氨基酸为亲水性的氨基酸且多于疏水性的氨基酸，表明ＰＧＲＰ－Ｓ２逡逑所编码的蛋白质为亲水性蛋白质，该结果跟Ｐｒｏｔｐａｒａｍ分析的结果一致。逡逑￣＇逦Ｈｐｈｏｂ．邋／邋Ｋｙｔｅ邋Ｓ＜邋Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ邋－逡逑２－５邋－ｆＡ逡逑２邋￣邋Ｉ邋Ｉ逦逦－逡逑＂１：邋％邋＇（）邋ｙ邋，邋Ｉ邋Ｌ逦■逡逑：：：＿＿＿＿霉逡逑－２邋－逦Ｉ逡逑＿２邋５逦■逦ｉ逦ｉ逦１逦１逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑２０逦４０逦６０逦８０逦１００逦１２０逦１４０逦１６０逦１８０逡逑Ｐｏｓｉｔｉｏｎ逡逑图１－５邋ＰＧＲＰ－Ｓ２的亲疏水性分析逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－５邋Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ＰＧＲＰ－Ｓ２逡逑２１逡逑

曲线,信号,信号肽,蛋白

福建师范大学吴程硕士学位论文３．３．２信号肽与跨膜结构分析逡逑用ＳｉｇｎａｌＰ４．１分析该蛋白是否存在信号肽（图１－６），结果表明该蛋白存在一信号肽，其位置由起始位点开始至第２１个氨基酸结束。用ＴＭＨＭＭ预测该蛋白否存在跨膜结构（图１－７），结果表明该蛋白没有典型的跨膜曲线，其并未从细跨越至细胞外，指示该蛋白不存在跨膜结构。结合该蛋白含有信号肽，预测该为分泌蛋白，其发挥作用的机理是当受到外界的感染时，该蛋白由其信号肽指而分泌至细胞外与侵染物结合而发挥其作用。逡逑￣’０■邋ｓｃｏｒｅ逦＿邋逦：＂＂逡逑？逦逡逑

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