粘虫VgR基因的克

发布时间：2020-06-16 22:32

【摘要】：粘虫Mythimna separata(Walker)隶属于鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuide),是一种重要的世界性农业害虫。粘虫之所以在各地频繁爆发以致成灾,与其强大的生殖力和特殊的生殖适应性密不可分。围绕生殖调控决定生殖潜能与适应性这一问题,开展生殖相关基因的研究是必要的。卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor,VgR)作为介导脂肪体与卵巢间卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)转运的关键蛋白,对于卵黄的发生以及卵母细胞的发育和成熟具有重要作用。因此,开展此基因的相关研究具有重要的理论意义。本文对粘虫卵黄蛋白受体VgR基因cDNA全长序列进行了克隆、表达模式的建立以及功能的鉴定,旨在为粘虫生殖机制提供理论基础。本文利用反转录PCR(everse transcription-PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了粘虫的VgR基因的全长cDNA序列,并对其进行了生物学信息分析。然后以β-Tubulin作为内参基因,运用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)技术建立了该基因在粘虫不同发育阶段以及不同组织的表达模式,并通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对VgR基因进行沉默,探究其差异性以进一步确定该基因功能。1.粘虫VgR基因cDNA全长为5380 bp,开放阅读框ORF为5328 bp,起始密码子ATG位于16-18位核苷酸,终止密码子位于5341-5343位核苷酸,总共编码1775个氨基酸,分子量大小为198.995 kDa,等电点为5.11。粘虫VgR包含154个磷酸化位点,16个糖基化位。保守结构域分析结果表明,粘虫VgR蛋白为低密度脂蛋白受体,缺少O-糖链结构域(O-linked carbohydratesdomain,OLSD)。粘虫VgR蛋白包含两个配体结合域(Ligand-binding domain,LBD)和两个表皮生长因子前体同源域(EGF-precursor homology domain,EGFP)。两个配体结合域分别包括4个和7个A型重复序列(LDLa);其中一个EGFD包括4个B型重复基序和7个YXTD基序集群,而另一个EGFD由3个B型重复基序(LDLb)和2个YXTD构成。该蛋白存在跨膜区(Transmembrane domain,TMD),属于跨膜蛋白。VgR的信号肽位于N端起始位置,由MKYECLILVVLVTWCA EFA这20个氨基酸构成。系统发育树中,粘虫VgR与鳞翅目昆虫聚在一支,与同为夜蛾科的棉铃虫Helicoverpa armigera和斜纹夜蛾Spodoptera litura亲缘最近。2.本实验建立了VgR基因在粘虫雌蛾和幼虫不同组织中的表达模式。在雌蛾各组织中VgR均有表达,卵巢内表达水平显著高于其它组织,表皮中表达水平最低。在粘虫幼虫不同组织中的表达模式中,脂肪体内VgR基因相较于头部、表皮、肠道有显著表达,但表达量很低。3本实验建立了VgR基因在雌性粘虫不同发育阶段的表达模式,结果表明粘虫VgR基因主要在成虫期表达,表达量随羽化时间总体呈现先上升后下降趋势,于羽化第二天有明显表达上升,升至第五天达到顶峰,从第六天开始下降。4.本实验利用RNAi技术对VgR基因进行干扰,结果显示处理组(VgR-dsRNA)VgR基因的表达量于注射后48-60 h明显低于阴性对照组(GFP-dsRNA),说明干扰有效地抑制了卵黄原蛋白受体的表达。同时,分别将此两组的雌蛹培养至羽化第三天,然后将其卵巢进行解剖,对比发现,处理组的粘虫卵巢中卵子的卵黄蛋白的沉积明显受到抑制,发育较阴性对照迟缓,与该基因表达量检测结果一致。
【学位授予单位】：山西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433.4
【图文】：

粘虫,基因扩增,策略

山西师范大学硕士学位论文2.2.1.5 扩增策略及引物设计与合成基于粘虫的转录组数据，比对筛出 VgR 的预测序列，然后将该序列分成核心区域 A、5'末端全长 cDNA 序列 B 以及 3'末端全长 cDNA 序列 C 三部分进行分段克隆(图 2-1)。首先扩增中间片段，将其分成五部分段（A1、A2、A3、A4及 A5）设计引物逐步扩增，每个片段之间至少 50bp 重叠区以保证最终序列的完整。根据测序得到的核心区域片段A1和A5分别设计特异性引物VgR B1、VgR B2以及 VgR C1、VgR C2。5'端全长 cDNA 序列 B 使用引物 VgR B1、VgR B2 与 5'RACE 的接头引物 5' outer 和 5' inner 进行扩增，VgR C1、VgR C2 和 3' RACE 的接头引物 3' outer 和 3' inner 则用于进行 3'端全长 cDNA 序列 C 的扩增。将测序后获得的片段由 ContingExpress 软件拼接以获得粘虫VgR的全长cDNA序列，所用引物见表 1 (表 2-3)。

粘虫,凝胶,电泳,说明书

3 结果隆检测说明书步骤提取粘虫腹部的总 R图 3-1 所显示，图中具有三条清5s，其中 18s 最亮，5s 最暗，18s 完整性较好。利用紫外分光光在 1.8-2.0 之间，杂质较少，表明

【参考文献】