EphrinB2基因在肛门直肠畸形大鼠胚胎后肠发育中的表达分析

发布时间：2020-06-17 02:04

【摘要】：目的:肛门直肠畸形(Anorectal Malformations,ARM)是儿科较常见的消化道畸形,世界范围内发病率约为1/5000~1/1500。广泛的人体标本及动物模型研究表明ARM的发生与基因突变有密切关联,但其主效基因尚未明确。在已有的相关研究中,Eph(Erythopoietin producing hepatoma cell line)家族作为最大的酪氨酸蛋白激酶受体家族参与细胞生长、增殖、转化及胚胎发育和肿瘤形成。本研究在Wistar大鼠怀孕第10天时利用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)灌胃对其胎鼠致畸,建立ARM动物模型,继而在基因及蛋白等不同水平检测正常胎鼠和ARM胎鼠的肛门直肠发育过程中直肠末端EphrinB2的表达,旨在探讨EphrinB2在正常和肛门直肠畸形的胚胎发生机制中的时空性作用。研究方法:1.动物模型的建立选取体重220~280g Wistar雌性大鼠79只,体重250~300g Wistar雄性大鼠(购自中国辽宁长生生物技术有限公司),按雌雄比例5:1午夜合笼,次日8:00阴道涂片发现精子视为受孕,记为怀孕第0天(Embryonic day0,E0),于孕鼠怀孕第10天(E10)经胃管给予125 mg/kg的ETU(购于德国Aldrich公司),制作ARM胎鼠动物模型,对照组给予等量的生理盐水。选择胎龄13~16天时剖宫取出完整胚胎,辨别畸形后分为正常组和ARM组。2.免疫组化染色(Immunohistochemical-paraffin section,IHC-P)石蜡包埋:4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定;脱水;石蜡包埋。组织切片:选取胚胎正中矢状面连续切片,片厚4μm,选取可以看到直肠和尿道的玻片留存。免疫组化染色:将切片逐步脱蜡水化,抗原热修复,按说明书依次滴加试剂盒内相关试剂,镜下观察DAB及苏木素染色,自来水冲洗反蓝,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。3.显微取材于解剖显微镜下用显微器械于无菌条件取生殖结节置于EP管中,制作标本池,于-80℃冷藏,备Western blot及qRT-PCR实验之用。4.Western blot及qRT-PCR在蛋白及分子水平检测EphrinB2的表达情况(1)提取总蛋白进行Western blot实验蛋白定量分析,其结果经ProtoBlot II AP分析系统扫描对蛋白质含量进行密度分析,以相对灰度值代表其蛋白表达量。(2)提取总RNA,反转录为cDNA,用ABI7500荧光定量PCR仪进行PCR反应,采用2~(-△△ct)分析目的基因mRNA相对表达量的变化。5.统计分析数据均以均值±标准差表示,差异比较采用IBM SPSS Statistics 21统计软件进行配对t检验,以P值表示统计差异,P0.05认为差异有统计学意义。结果:1.ETU制作ARM胎鼠动物模型ETU致畸组中,致畸率可达89%以上,大体上表现为无尾或短尾畸形,石蜡切片可观察到ARM胎鼠表现为尿直肠膈未与泄殖腔膜融合,直肠和泌尿生殖道之间存在瘘道,或形成永久泄殖腔。2.免疫组化染色结果EphrinB2在正常和ARM胎鼠末端直肠胚胎发育过程中均有表达。正常组:在胚胎发育过程中,从E13到E16,表达逐渐增强,呈一个上升的趋势,主要表达在泄殖腔及后肠的粘膜层。在ARM组:EphrinB2在E13~E16表达强于正常组。3.Western blot及qRT-PCR在蛋白及分子水平检测EphrinB2的表达情况Western blot和qRT-PCR结果显示在正常组中EphrinB2的表达随着胎龄的增加呈现出上升趋势,而ARM组的表达要高于正常组,在E13天差异尤为显著(P0.05)。结论:EphrinB2在胎鼠泄殖腔分化、肛门直肠形成时期有表达,且存在时空表达的不平衡,认为其可能在大鼠胚胎期泄殖腔和直肠发育过程中起作用;EphrinB2在畸形组胚胎发育的中早期,泄殖腔逐渐分化为尿道和消化道时明显表达上调,提示EphrinB2基因在胚胎中早期表达的增高可能与ARM的发生相关。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.7
【图文】：

中国医科大学硕士学位论文3.2 免疫组织化学染色结果胎龄 13 天，正常组：尿直肠膈开始下降把泄殖腔分成腹侧的尿生殖窦和背侧的原始直肠，泄殖腔管呈蝶形。EphrinB2 阳性细胞分布在泄殖腔上皮，尿直肠膈出仅见少许表达 (图 1A, B)。 ARM 组：尿直肠膈尖端和泄殖腔膜之间的距离较长。EphrinB2 阳性细胞密集广泛分布于尿道，尿直肠膈和后肠上皮 (图 1C,D)。

中国医科大学硕士学位论文E14，正常组：尿直肠膈尾端接近泄殖腔膜。EphrinB2 阳性细胞广泛分布在尿道和后肠粘膜层，尿直肠膈和泄殖腔膜表达不明显（图 2A, B）。ARM 组：尿直肠膈在泄殖腔里的位置较高，尿直肠膈和泄殖腔膜之间的距离较远。EphrinB2阳性细胞广泛分布，在尿直肠膈表达较正常组明显（图 2C, D）。

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本文编号：2716915