油菜乙酰辅酶A结合蛋白1（BnACBP1）的基因功能研究

发布时间：2020-06-18 01:12

【摘要】：油菜作为冬季种植的油料作物,在我国南方地区形成了与水稻轮作的种植方式。但目前推广的甘蓝型油菜品种生育期较长,会影响后茬水稻种植也容易受环境逆境的影响,从而限制了油菜的推广使用及土地的高效利用,因此培育生育期较短且产量较高的油菜早熟新品种具有较高的实际生产价值。本实验室前期用不同发育时期油菜种子为材料通过iFox-Hunting方法建立了一个可诱导油菜基因表达的拟南芥功能获得型突变体库,并从中筛选出一个具有叶片提前衰老表型的突变体rsl-1327。本研究对该突变体的插入基因进行研究,并结合转录组分析结果深入探讨了该突变体在诱导剂处理时出现叶片提前衰老的作用机制,为将来利用该突变体插入基因BnACBP1(油菜乙酰辅酶A结合蛋白1)培育油菜早熟品种提供理论指导。其主要结果如下:1、首先对突变体rsl-1327的叶片提前衰老表型进行了统计描述,发现在诱导剂处理情况下4周左右会出现叶片提前衰老表型,且其衰老速率、终花期、成熟期显著快于野生型拟南芥和未诱导处理突变体。同时无论是生理水平的叶绿素含量,还是分子水平的衰老marker基因SAG12表达量都出现了显著的升高或降低。2、为了深入研究该突变体,我们通过载体引物克隆了突变体rsl-1327的插入基因,并对该基因氨基酸序列的高级结构进行分析,发现该蛋白头部有一个跨膜结构域,且主要由α螺旋和自由卷曲的高级结构组成。随后对DNA序列进行同源比对,发现该插入基因与ACBP家族的ACBP1同源关系最近。又因该突变体基因来源于油菜,故将该基因的蛋白序列和油菜、拟南芥的ACBP1蛋白序列进行比对,并深入分析了蛋白的功能域,发现它们蛋白的功能域具有极强的保守性,其中突变体插入基因与油菜A2染色体上的BnaA02g10270D(BnACBP1-2)具有极高的相似性,因此我们认为它们之间的微小区别是由品种间的差异引起。3、为了进一步确定突变体的叶片提前衰老表型是否由插入基因引起,我们克隆了突变体基因并将其重新转入拟南芥中,进行稳定过表达验证,发现35sBnACBP1-2转基因系同样出现了叶片提前衰老表型,并且其衰老程度与35sBnACBP1-2的表达量高低有关。随后我们选取了2个转基因系对其叶绿素含量和衰老marker基因SAG12的表达量进行了测定,均说明叶片出现了衰老。同时利用GFP抗体通过Western Blot在蛋白水平验证了具有叶片提前衰老表型的转基因系中BnACBP1-2蛋白确实表达了。4、随后对油菜中2个ACBP1基因的亚细胞定位、表达模式和脂肪酸组成进行了分析。通过原生质体转化发现,油菜ACBP1基因均定位于原生质体的内质网和质膜,与拟南芥ACBP1相同。检测westar油菜中不同组织和时期BnACBP1的表达情况,发现其在种子发育后期、根和花蕾的表达量较高,并分别克隆油菜2个ACBP1基因的启动子区域,通过GUS染色分析发现其主要在成熟胚、幼苗根部及成熟花粉中表达,与BnACBP1表达量的分布情况相一致。同时GUS染色分析还发现叶片受伤处理后可以被染色,通过检测受伤处理前后GUS基因的表达发现健康叶片中GUS基因也有一定表达,且在受伤处理后大幅升高,这说明BnACBP1可以响应受伤刺激。又因BnACBP1蛋白本身与脂肪酸转运有关,所以我们又测定了BnACBP1-2过表达转基因系中脂肪酸的组成,发现叶片中18碳不饱和脂肪酸的含量增加。这些与拟南芥ACBP1都有差异,因此认为油菜的ACBP1基因在功能上可能发生了分化。5、从DNA水平到蛋白水平确定BnACBP1-2的过表达会引起叶片的提前衰老之后,结合转录组测序分析发现在诱导BnACBP1-2表达时α-亚麻酸代谢途经和茉莉酸代谢途经相关基因表达量明显出现差异,为了验证这一结果我们测定了35sBnACBP1-2转基因系的茉莉酸和氧化脂类含量,发现其含量显著增加,并且茉莉酸处理诱导了BnACBP1的表达。同时35s BnACBP1-2在茉莉酸代谢途经障碍的突变体lox3、lox4、coi1背景中,叶片提前衰老表型也出现了不同程度的被抑制,由此说明BnACBP1-2过表达引起的叶片提前衰老与其影响了茉莉酸的代谢途经有关。又因茉莉酸本身在植物抗病虫害中具有重要意义,故选取了灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)对油菜35s BnACBP1-2转基因系接菌观察,发现该转基因系对灰葡萄孢菌具有显著的抗性。通过对本研究结果的总结,推测BnACBP1-2过表达引起叶片提前衰老是因其增加了对内质网中不饱和脂肪酸向质体的转运,使质体中的亚麻酸含量增加,使得增加的亚麻酸被氧化成氧化脂类,并进一步被合成为茉莉酸,导致茉莉酸的积累而启动下游信号响应引起衰老。同时因BnACBP1可响应受伤和茉莉酸处理的诱导表达,且茉莉酸本身与植物抗病虫害密切相关。因此对油菜中ACBP1的研究有助于我们深入了解脂肪酸转运对植物生长发育及抗病虫害的影响,对油菜的作物育种和生产也具有重要的理论指导意义。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S565.4
【图文】：

过程图,叶片衰老,过程,叶绿素

图 1. 调节叶片衰老的主要过程（Wojciechowska et al 2018）Fig. 1 Main processes that regulate leaf senescence1.1.1.1 叶绿素的降解由于叶绿素损失，叶片黄化是叶片衰老的第一个可见症状，因而与叶绿体变性相关的叶绿素快速损失经常用作衰老开始的生物标志。叶绿体蛋白质的分解提供了氮的主要来源，叶绿素需要从叶绿素结合蛋白中去除以使其可以降解（Thomas et al2001），未结合的叶绿素也对细胞有毒性，需要适当降解以避免自由基产生（Matile1992）。叶绿素降解开始于叶绿体中，并涉及几个亚细胞区室的复杂酶催化途径（Thomas et al 2001, H rtensteiner and Feller 2002），其由多个酶促反应组成，这些反应产生不同短暂寿命的中间体和叶绿素，最终在衰老细胞的液泡中积累（H rtensteiner and Kr utler 2011）。最近，叶片衰老期间叶绿素分解的调节机制在各

叶片衰老,发育阶段,叶片发育

图 2. 叶片衰老调控网络（Akhtar et al 2018）Fig. 2 The leaf senescence regulatory network叶片发育经历生长，成熟和衰老阶段（Guiboileau et al 2010），其衰老的开始主决于发育阶段的变化。衰老诱导只发生在特定的发育阶段（Jibran et al 2013），衰老可以通过各种激素和环境因素诱导和调节。据观察，即使在没有生物和非胁迫的情况下，叶片衰老最终也会以年龄依赖的方式发生并发展（Hensel et al

【参考文献】