双功能酸性脲酶的全基因表达与复性及固定化研究

发布时间：2020-06-18 08:10

【摘要】：双功能酸性脲酶是一种能水解尿素和氨基甲酸乙酯(EC)的多功能酶,EC是一种潜在致癌物,尿素为其前体物;本论文成功将酸性脲酶在大肠杆菌中表达,通过对复性条件的探索及优化,复性了在E.coli BL21(DE3)中表达形成包涵体的重组酸性脲酶,并优化了复性后脲酶的固定化条件,分析了固定化酶的酶学特性,初步研究了具备EC降解酶功效的固定化酸性脲酶在黄酒中的应用。首先提取了P.rettgeri JN-B815的基因组,设计引物P1、P2从基因组中扩增酸性脲酶全基因组,成功构建了重组质粒pET-42a-ureABCEFGD,将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中表达,当IPTG浓度在0.4 mmol·L~(-1)时,脲酶酶活达到0.4 U·m L~(-1),EC降解酶酶活达到0.13 U·m L~(-1)。构建了重组质粒pCold-ureABCEFGD在E.coli BL21(DE3)表达,对形成的包涵体两次清洗,蛋白回收率达到53±3%,优化了包涵体溶解条件,在含有8 mol·L~(-1)urea、0.05 mmol·L~(-1) DTT、0.05 mol·L~(-1)Arg的缓冲液中(pH8.0)溶解8 h,蛋白质回收率达到95±3%。对溶解的包涵体复性,在稀释复性中,在GSSG/GSH(氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽)=10/1、精氨酸1.5%(w/v)、20%甘油(v/v)复性液中稀释16倍,复性效果达到最好;在梯度透析复性中,在35倍的稀释复性液中透析复性总时48 h左右时,复性效果最佳;基于稀释复性的稀释-超滤复性,在2000 rpm·时,酶活达到最高。所得脲酶过镍柱纯化,稀释复性的脲酶和EC降解酶酶活8.1±0.8 U·mg~(-1)、2.7±0.3 U·mg~(-1);梯度透析的脲酶和EC降解酶酶活为10.8±1 U·mg~(-1)、3.4±0.3 U·mg~(-1);超滤-稀释的脲酶和EC降解酶酶活12.3±1 U·mg~(-1)、3.8±0.5 U·mg~(-1),三种方法复性的蛋白质回收率分别为24±5%、22±4%、21±4%。氧化石墨烯(GO)和壳聚糖(CS)复合微球固定化酸性脲酶,并对主要条件进行优化,发现在GO和CS的质量比为3/2时,两者结合时间为8 h,戊二醛浓度为2.5%,交联8 h后,酶活力回收率可以达到74%。该固定化脲酶在65℃的半衰期为400 min,在20%乙醇浓度以下可保持80%的酶活;在重复使用10次后对底物尿素和EC的催化能力依然保持90%以上。固定化脲酶的Km为9.15 mmol·L~(-1)(尿素),383.86 mmol·L~(-1)(EC),Vmax为1.08μmol·min~(-1)(尿素),0.78μmol·min~(-1)(EC)。考察固定化酸性脲酶在流化床反应器中处理黄酒时的应用效果,在加酶量为20 U,流速为0.4 m L·min~(-1)时反复处理4次后,50 mL黄酒的尿素的去除率可以达到93.85%,EC的去除率可以达到57.46%。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q814
【图文】：

目的基因的扩增图

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M：DL10000 Marker; 1：PCR 产物图 3-1 目的基因的扩增图Fig.3-1 PCR amplification of ureABCDEFG组扩增的基因大小在 5.4 kb 左右，大小符合目的基因的（5437 bp）。酶重组质粒的构建

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