基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法生物基因定性、定量、高通量检测技术研究

发布时间：2020-06-19 04:15

【摘要】：检测食品和饲料中的转基因成分和致病菌在原料控制、食品产业、食品销售中尤为重要。而传统的生物基因定性、定量检测技术每次只能检测一种生物基因,而对于成分复杂的核酸样品,需要采用多种方法、进行多次实验才能确定,费时、费力、成本高。虽然常规多重PCR已应用于同时检测多种生物基因,但在同一反应中,经常会优先扩增短片段,并且同时扩增多个目的基因的效果常常很差。而且常规多重PCR通过电泳进行检测,只能定性,不能定量,通量有限。实时荧光定量PCR技术可以通过标准曲线对模板进行定量分析,但因其有限的检测通道,检测通量不高。基因芯片技术可以实现对核酸样品的高通量检测,但由于定量效果不好,制备过程复杂,费用高昂等缺点并没有得到广泛的应用。因此,研究一种可以同时对多种核酸样品进行定性、定量和高通量检测的方法就显得非常重要。我们将微滴PCR技术与荧光标记技术结合起来建立了一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法生物基因定性、定量、高通量检测方法。微滴PCR技术是将反应水相逐滴地加入油相中,形成均一的“油包水”乳化剂,包含109个油包水的微滴,每个微滴都可以作为一个微反应器,独立地平行地进行PCR扩增。微滴PCR技术,提高了PCR反应的通量,由于每个微反应器中只含有1-2个模板,因此避免了模板与模板之间的干扰,同时降低了对宝贵的试剂和样品的消耗。本方法采用荧光标记技术和荧光酶标仪检测荧光基团荧光强度来实现多重微滴PCR多种扩增产物的定性、定量和高通量分析。在不同生物基因的特异性引物的5’端标记不同的荧光基团,经过微滴PCR扩增和产物纯化后,每一种微滴PCR产物都会被标记上特定的荧光。不同的产物由不同的荧光识别,通过荧光酶标仪荧光强度测定可以对实现不同生物基因的定性、定量分析。在同一个反应管中,每种DNA分子都由特定的的荧光标记,因此将微滴PCR与荧光分光光度法结合起来,可以通过384孔酶标板可以实现高通量检测。本研究以转基因玉米(BT176、GA21、NK603和TC1507)为实验材料对这一理论进行了验证。首先分别设计它们旁临序列的特异性引物,选择合适的荧光基团对各对引物的5’端进行标记,配制相应的微滴PCR反应液和乳液,反应液和乳液在搅拌子的作用下混匀形成微滴,经过微滴PCR扩增和产物纯化后,用酶标仪检测产物中相应荧光基团的荧光强度来同时对四种转基因玉米进行定性、定量分析。单重特异性实验表明,BT176、GA21、NK603和TC1507品系特异性引物和内标基因特异性引物的特异性均很好,无交叉反应。单重灵敏度实验表明微滴PCR偶联荧光分光光度法可检测低至0.5%的转基因玉米,灵敏度高。单重定量检测四种转基因玉米的检测限为103拷贝,且线性关系良好,说明微滴PCR偶联荧光分光光度法可用于转基因样品的定量检测。多重微滴PCR偶联荧光分光光度法实验表明,该方法的特异性很好,灵敏度很高,可用于定性和定量分析检测四种转基因玉米混合物。多重重复性实验表明,批内各个转基因玉米的扩增变异系数都在3%以内,说明该研究中建立的实验方法是稳定可靠的,批间各个转基因玉米的变异系数都在15%以内,同样说明了本研究中建立的实验方法的重复性很好。模拟样品检测实验结果表明,模拟百分含量的四种转基因玉米经过微滴PCR扩增后进行荧光值测定,得出的GM含量基本与事先预混的样品的理论值接近,因此,该实验方法可实际应用于转基因玉米的定量和百分含量分析。通过以上实验进行验证得出,利用多重微滴PCR偶联荧光分光光度法可实现四种转基因玉米(BT176、GA21、NK603和TC1507)的定性、定量和高通量检测。以食源性病原菌为实验材料对微滴PCR偶联荧光分光光度法这一技术进行重演性分析。重演性分析实验表明,以转基因玉米为实验材料建立的基于重微滴PCR偶联荧光分光光度法可成功应用于四种食源性病原菌的定性、定量和高通量分析。重演性结果可以说明,本研究中建立的多重微滴PCR偶联荧光分光光度法可以用于所有生物基因的定性、定量和高通量检测。本研究采用的引物荧光标记技术对靶基因的大小和序列没有要求,是根据标记的荧光基团进行识别的,只要引物特异性好,能特异性扩增靶基因,微滴PCR产物就能被识别。这对于DNA序列同源性很高,保守区很短的多种基因同时检测优势尤为明显。采用荧光酶标仪对标记后的微滴PCR产物进行检测非常快速,检测一种基因只需1秒钟时间。Thermo Varioskan Flash多功能酶标仪的激发波长范围为200-1000 nm,对荧光基团的激发波长和发射波长进行适当调整,可同时检测20种荧光标记物,使用384孔酶标板,则一次可检测6000多种基因。微滴PCR偶联荧光分光光度法提高了目的基因检测和分析的通量,具有方便、快速、成本低廉、易于推广、环境污染少等优点,可用于所有生物基因的定性、定量和高通量检测。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q503
【图文】：

荧光探针法

体系存在的双链 DNA 数量。特异性 Taqman 荧光定量法是以 Taqman 荧光探针为基础，Taqman 荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团（图 1-1）。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物的形成完全同步，从而实现定量。常用的荧光基团有 FAM、TET、VIC 和 HEX 等。RT-PC技术已成功应用于转基因大豆、玉米和甜菜等作物转基因成分的检测，其检测灵敏度可达 0.01%以下[46]。郑秋月等[47]根据金黄色葡萄菌种属鉴定 nuc 基因和MRSA 决定因子 mecA 建立了 TaqMan 探针双色荧光 PCR 方法快速检测金黄色葡萄球菌, 灵敏度达到 2.7×103cfu/mL, 且检测过程只需 1 h 左右，极大缩短了检测周期。RT-PCR 可以实现目的基因的定量检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、无需后续电泳、不开盖、核酸交叉污染少、易于自动化等优点，有效解决了传统定量只能终点检测的局限，但因仪器设备的检测通道有限，检测通量不高，且需要操作熟练的技术人员，检测费用昂贵。因此其普及应用在一定程度上受到制约。

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uno 2003[51]年利用油包水(W/O)的乳液来进行 PCR，它的混合物。这些液滴在高温条件下能保持稳定并且充当微型 DNA 模板的有效浓度，甚至是低浓度 DNA 模板，目前成。第一步是制备 W/O 乳液。在该步骤中，模板 DNA 滴中进行扩增。第二步将乳液进行破碎。该方法很容易应子。Richad Williams 2006 年[52]报道，通过 PCR 有效扩种现象阻碍：首先在同一反应管中进行多重 PCR 效果很扩增，其二，在同源区会重组产生人工片段。由此，他报术将油相和 PCR 反应体系的水相进行乳化，模板 DNA 微滴中，分开进行 PCR 扩增复杂基因文库。这种方法使和进行高循环数成为可能。PCR 混合物的成功乳化能显比起非乳化的高出大约七分之一的值。所以，微滴 PC扩增，减少引物与引物，模板与模板之间的相互干扰，提率。

【参考文献】