迟缓爱德华氏菌功能基因组和条件必需基因的筛选

发布时间：2020-06-19 22:36

【摘要】：迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellaa tarda),是一种在淡水和海水鱼类中常见的致病菌,同时也是一种重要的人畜共患病病原菌。本课题组已率先完成了迟缓爱德华氏菌全基因组测序和比较基因组研究,然而对该菌大部分的编码基因功能仍然不清楚。本课题使用转座子随机插入突变文库和蛋白质组学等系统生物学方法对迟缓爱德华氏菌的功能基因组进行初步解析。首先,本课题利用转座子随机插入基因组,对基因或基因间区域进行失活并建立突变体文库。本课题使用编码martner转座子的pMar2XT7质粒为出发质粒,将其改造成为包含绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和卡那霉素抗性基因的转座子pMKGR,对迟缓爱德华氏菌EIB202株进行大规模突变株文库的构建。总共获得了 20325株突变株,并利用半任意PCR方法,测定了每个突变株的插入位点。文库中的突变株覆盖了 2776个基因,占所有预测基因总数中的77%。本文库是迟缓爱德华氏菌属和鱼类病原菌的第一个位点确定的大规模插入失活突变株文库,可用于系统性地筛选不同条件下必需基因,以及基于荧光报告基因对该菌的基因表达调控进行研究。第二方面,本课题使用转座子插入测序技术(Transposon insertion sequencing，TIS)系统分析该菌各种条件下的条件必需基因。TIS技术将转座子大规模随机突变文库与高通量测序技术相结合,用以精确测定突变株的插入位点和数量,由此可以追踪并筛选细菌在不同条件下的必需基因集合。本研究使用mariner转座子pMar2XT7,构建了一个含有约30万个单菌落(CFU)的插入失活随机突变株文库。在此基础上利用统计和模拟的方法进行必需基因分析,确定迟缓爱德华氏菌在富营养培养基LB条件下生长所必需的498个基因,约占总基因数量的13.8%。接着本课题将突变株文库在体外条件下进行筛选,包括实验室培养条件(即细菌培养基LB连续培养)筛选得到221个必需基因;模拟细胞内环境的DMEM培养条件下,筛选得到180个必需基因;用取自养殖场的天然海水在16℃和28℃条件下分别筛选得到82个和130个必需基因;利用J774.1巨噬细胞细胞模型,筛选得到86个必需基因。本课题进一步将突变株文库在鱼体内条件下进行筛选,使用迟缓爱德华氏菌EIB202的天然宿主一大菱鲆(Scophthalmus maxiimus L.)作为感染对象。以大菱鲆宿主的肝脏为感染模型，筛选鉴定得到迟缓爱德华氏菌感染肝脏必需的228个基因/基因间区域。其中包含已报道的重要的毒力相关基因,如三型分泌系统(T3SS)和六型分泌系统(T6SS),同时得到大量未报道的与感染和致病过程相关的基因,并对它们进行了功能分类和体内感染过程功能验证。相较于传统的TIS中单纯比较原始和筛选后文库的二元比较,本课题进一步将TIS拓展到感染过程时间序列分析,即在病原菌感染中最关键的14天中,分别在6个时间点取样,考察该菌从侵染到爆发整个过程中必需基因的动态变化过程。建立了一种突变株体内生存必需性的模式分析的方法(Pattern analysis of conditional essential loci,PACE),获得了全基因组范围各基因对该菌体内存活能力贡献和影响的体内动态曲线,并对所有基因位点的动态曲线进行了聚类分析。其中最重要的一类为“缓慢清除”曲线(Mitifits),这一类曲线包含了主要的毒力基因(T3SS和T6SS)。并由此揭示T3SS/T6SS突变株能够在体内定植和存活一定的时间,但无法像野生型那样进一步爆发致病的特征。进一步利用各基因的动态曲线,找到了减毒活疫苗靶点基因的“先存活后清除”动态特征,在此基础上进行启发式搜索,得到89个候选减毒活疫苗靶点。选择其中5个候选基因(分别编码叶酸代谢基因pabA，pabB;肽聚糖合成途径中的ETAE 2260;前噬菌体调控基因ETAE_1614;以及保守的假定蛋白ETAE_0023)构建了缺失突变株,进行体内存活能力验证和免疫保护临床试验。结果表明它们的突变株在体内生存过程符合缓慢清除的特征,均可以激发宿主的免疫反应,野生株攻毒后的免疫保护力(RPS)大于60%,其中pab和ETAE_2260突变株的免疫保护力高于已知的减毒活疫苗株WED。最后,为掌握迟缓爱德华氏菌基因组中3599个蛋白编码基因之间相互作用关系,本研究使用生物信息学方法构建了蛋白与蛋白相互作用网络。首先,使用Interlog和DDI方法,提取蛋白质相互作用网络数据与迟缓爱德华氏菌进行同源比对,基于相关性互作的原理,构建蛋白与蛋白相互作用网络,共计获得139041对蛋白与蛋白相互作用(包含2514个蛋白),绘制了第一个迟缓爱德华氏菌的多维度分析的蛋白与蛋白相互作用网络。同时,对相互作用网络进行了统计分析,获得网络的模型。进一步将蛋白质相互作用网络中的枢纽蛋白进行分析,建立抗原-蛋白相互作用模型,筛选到了 15个新的抗原蛋白,为将来研究新型的亚单位疫苗奠定了基础。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78
【图文】：

序列,状态分类,完整基因组,功能基因组学

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状态分类,基因组,年份,数据库

逦２０１５逡逑ＹＥＡＲ逡逑图１．２完整基因组和基因组草图数量（ＧＯＬＤ数据库，以年份和状态分类）逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ａｎｄ邋Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ邋Ｄｒａｆｔ邋Ｇｅｎｏｍｅ邋Ｔｏｔａｌｓ邋ｉｎ邋ＧＯＬＤ邋（ｂｙ邋ｙｅａｒ邋ａｎｄ邋ｓｔａｔｕｓ）［１３］．逡逑Ｇｅｎｏｍｅ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋Ｐｒｏｊｅｃｔｓ逡逑１６＊０００逦—邋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ逡逑逦Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ逡逑ｉ：．邋Ａ＼逡逑２００７逦２００８逦２００９逦２０１０逦２０１１逦２０１２逦２０１３逦２０１４逦２０１５逦２０１６逡逑ＹＥＡＲ逡逑图１．３邋ＧＯＬＤ数据库中所有的基因组数量（以年份和状态分类）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｇｅｎｏｍｅ邋ｔｏｔａｌｓ邋ｉｎ邋ＧＯＬＤ邋（ｂｙ邋ｙｅａｒ邋ａｎｄ邋ｓｔａｔｕｓ）１＇逡逑在基因组学飞速发展的同时，功能基因组学的概念也随之提出。功能基因组学的逡逑研究目的是利用基因组测序所获得的大量数据，来进一步解释基因和蛋白的功能和相逡逑互作用关系。功能基因组学关注生物动态变化的过程，例如转录，翻译，蛋白与蛋白逡逑相互作用，这扩展了静态的基因信息，如ＤＮＡ序列和结构。功能基因组学的目标是阐逡逑释基因组中的ＤＮＡ，转录后的ＲＮＡ和翻译后的蛋白质这几个层次中所发挥的功能。相逡逑较于传统的单个基因研宄，功能基因组学的重要特征是宏观地通过全基因组，应用高逡逑

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