草甘膦抗性和磷高效吸收复合基因转化玉米的研究

发布时间：2020-06-20 00:09

【摘要】：【目的】草甘膦是世界上用途最广的除草剂之一,磷是玉米生长发育所必需的大量营养元素,培育抗草甘膦兼具高效磷素吸收利用的复合性状对玉米生产有重要意义.【方法】构建由Ubiquitin1启动子驱动的两种叶绿体转运肽/CP4 EPSPs融合基因,和根特异性启动子GLU1P驱动的植酸酶基因phyA2双价植物表达载体,通过农杆菌介导法对玉米茎尖进行转化.对转基因植株进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析、不同浓度草甘膦检测以及丙酮-磷钼酸铵法测定.【结果】获得9株阳性转基因植株;发现不同转运肽对EPSPs基因的表达量影响不同,且对草甘膦的抗性也不同;转基因植株植酸酶活性比野生型植株平均提高18.7倍.【结论】本研究为获得具有草甘膦抗性和磷素高效吸收利用复合性状的转基因玉米优良种质奠定了基础.
【图文】：

收目的片段，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，获得重组子ｐＣＥ－ＮＧＣ和ｐＣＥ－ＮＧＭ；再用ＥｃｏｒＲⅠ和ＳａｃⅠ分别酶切ｐＭＤ－ＵＢＩ、ｐＣＥ－ＮＧＣ和ｐＣＥ－ＮＧＭ，回收目的片段，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，获得重组子ｐＣＥ－ＮＧＣ２和ｐＣＥ－ＮＧＭ２；最后用ＸｍａⅠ分别酶切ｐＣＥ－ＮＧＣ２和ｐＣＥ－ＮＧＭ２，用Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ无缝连接技术将ｐｈｙＡ２基因连入，获得重组子ｐＣＥ－ＮＧＣ３和ｐＣＥ－ＮＧＭ３．图１ｐＣＥ－ＮＧＣ３表达载体结构Ｆｉｇｕｒｅ１ＣｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｐＣＥ－ＮＧＣ３ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ图２ｐＣＥ－ＮＧＭ３表达载体结构Ｆｉｇｕｒｅ２ＣｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｐＣＥ－ＮＧＭ３ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ采用ＣａＣｌ２冻融法［２８］分别将２种重组植物表达载体ｐＣＥ－ＮＧＣ３和ｐＣＥ－ＮＧＭ３导入农杆菌ＥＨＡ１０５感受态细胞，将转化的细胞均匀涂布于含卡那霉素和利福平的ＹＥＰ固体培养基，２８℃暗培养２８～３０ｈ，挑取单菌落接种到含上述抗生素的ＹＥＰ液体培养基，２８℃震荡培养２８ｈ左右，提取质粒，用特异性引物Ｕ１／Ｕ２进行ＰＣＲ鉴定，并保存农杆菌工程菌用于植物转化．１．６农杆菌介导的玉米转化及鉴定挑选饱满的玉米自交系种子，用７０％的乙醇浸泡８ｍｉｎ，然后用０．１％的升汞浸泡６ｍｉｎ，再用无菌水冲洗４次，然后用无菌水室温浸泡４～６ｈ，再

ＢＩ、ｐＣＥ－ＮＧＣ和ｐＣＥ－ＮＧＭ，回收目的片段，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，获得重组子ｐＣＥ－ＮＧＣ２和ｐＣＥ－ＮＧＭ２；最后用ＸｍａⅠ分别酶切ｐＣＥ－ＮＧＣ２和ｐＣＥ－ＮＧＭ２，用Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ无缝连接技术将ｐｈｙＡ２基因连入，获得重组子ｐＣＥ－ＮＧＣ３和ｐＣＥ－ＮＧＭ３．图１ｐＣＥ－ＮＧＣ３表达载体结构Ｆｉｇｕｒｅ１ＣｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｐＣＥ－ＮＧＣ３ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ图２ｐＣＥ－ＮＧＭ３表达载体结构Ｆｉｇｕｒｅ２ＣｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｐＣＥ－ＮＧＭ３ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ采用ＣａＣｌ２冻融法［２８］分别将２种重组植物表达载体ｐＣＥ－ＮＧＣ３和ｐＣＥ－ＮＧＭ３导入农杆菌ＥＨＡ１０５感受态细胞，将转化的细胞均匀涂布于含卡那霉素和利福平的ＹＥＰ固体培养基，２８℃暗培养２８～３０ｈ，挑取单菌落接种到含上述抗生素的ＹＥＰ液体培养基，２８℃震荡培养２８ｈ左右，提取质粒，用特异性引物Ｕ１／Ｕ２进行ＰＣＲ鉴定，并保存农杆菌工程菌用于植物转化．１．６农杆菌介导的玉米转化及鉴定挑选饱满的玉米自交系种子，用７０％的乙醇浸泡８ｍｉｎ，然后用０．１％的升汞浸泡６ｍｉｎ，再用无菌水冲洗４次，然后用无菌水室温浸泡４～６ｈ，再用升汞消毒１０ｍｉｎ，无菌水冲洗５次，２８℃黑暗条件下萌发．发芽后转到萌发培养基上继续生长，待苗长至４ｃｍ高时，剥去胚芽鞘和

【参考文献】

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