BpNAC012基因调控木质部发育基因表达谱分析

发布时间：2020-06-20 08:17

【摘要】：NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,其分布范围包含了从苔鲜植物到高等双子叶植物。研究表明,NAC转录因子具有很多方面的功能,如参与植物生长,在细胞分裂和植株衰老中发挥作用,参与激素调控和信号转导,参与矿质元素营养和农作物品质改良,参与生物胁迫中植物的防御反应以及在非生物逆境中发挥作用。为了研究BpNAC012基因是否调控白桦木质部发育及次生细胞壁的合成,将BpAC012过表达、野生型和抑制表达转基因白桦的茎分别进行解剖学切片分析,来观察次生细胞壁的形成情况,结果发现3个月龄的BpNAC012过表达白桦植株木质部发育程度高于对照,抑制表达株系的木质部发育程度低于对照,说明BpNAC012在白桦木质部发育中起到一定的调控作用。并对转基因白桦和野生型白桦进行木质素、半纤维素和纤维素含量的测定,结果显示,以野生型白桦为对照时,BpNAC012基因过表达白桦中纤维素含量增加,BpNAC012基因抑制表达白桦中纤维素含量降低,结果说明BpBAC012基因能够调控白桦次生细胞壁的合成。为进一步研究BpNAC012调控白桦木质部发育及次生细胞壁合成的分子调控机制,利用高通量测序技术建立了过表达株系,抑制表达株系及野生型对照的数字表达谱。表达谱分析结果显示,三个转录组共获得178983条单一基因。GO功能注释最多的基因分别为三大类里的细胞程序、代谢、细胞、细胞部分、结合和催化活性等。参与基因最多的代谢途径是碳水化合物代谢。与对照相比,过表达株系OE中上调的基因有627条,下调的基因有229条,抑制表达株系中上调的基因有299条,下调表达的基因有207条。两个转录组中共有140条基因差异表达。差异表达基因的表达模式基本可以被分为6类,其中包括在过表达中上调,在抑制表达株系中下调;在过表达株系中下调,在抑制表达株系中上调;在过表达和抑制表达株系中都上调或者都下调的表达模式。过表达BpNAC012能够调控更多的基因表达变化。而抑制表达BpNAC012更多的是影响蛋白修饰和转运类基因的表达变化。在差异表达基因中,涉及受体信号通路,营养代谢,氨基酸合成,及苯丙烷生物合成相关代谢通路基因比较富集。BpNAC012的表达,能够调控纤维素、木质素合成及木质部发育相关基因的表达变化。在BpNAC012过表达株系中,鉴定到一些和纤维素合成相关的基因,如cellulose synthase-like protein E6 isoform X1、cellulose synthase A catalytic subunit 5 等;一些细胞壁合成相关酶类,如 Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase family protei,Fructose-1,6-bisphosphatase,glucan endo-1,3-beta-glucosidase 14-like,probable beta-1,3-galactosyltransferase 19,fasciclin-like arabinogalactan protein 2 等。同时,鉴定了一些与木质素合成及沉积相关的基因,如 p-coumaryl-CoA 3'-hydroxylase、phenylalanine--tRNA ligase alpha subunit、peroxidase等。此外,还鉴定了一些和木质部发育相关的基因wall-associated receptor kinase 和 Leucine-rich repeat protein kinase family protein 等。这些基因可能受BpNAC012的诱导,参与过表达转基因白桦木质部发育及次生细胞壁的合成。在抑制表达株系中,鉴定到一些木质部发育及细胞壁合成相关基因下调表达,如一些与纤维素合成、细胞壁合成及木质部发育相关的基因下调表达,如Cellulose synthase like G3、endo-1,4-beta-glucanase 1、UTP--glucose-1-phosphate uridylyltransferase、UDP-glucoronosyl/UDP-glucosyl transferase family protein、non-specific lipid-transfer protein-likeprotein、pectinesterase29、extensin-like、laccase-7 等。这些基因的下调,可能与抑制表达株系转基因白桦木质部发育迟缓,纤维素合成受阻相关。BpNAC012的表达,同时能够调控多种转录因子的表达变化。包括AP2-EREBP、Tify、WRKY、Orphans、bHLH、NAC、GRAS、C2H2、SWI/SNF、SET、MYB、HSF、AUX/IAA、ARF、Sigma70-like、mTERF、G2-like、C3H、HB、FAR1、CPP、ABI3VP1、TRAF、GNAT、C2C2-Dof和LOB等。说明在BpNAC012调控的转基因株系中,存在多个层级的转录调控,BpNAC012能够调控其它转录因子的表达;在过表达和抑制表达株系中,存在不同的调控模式,一些特异转录因子,在各自的性状变化中起着相应的调控作用。在此基础上,将差异表达分析筛选到的白桦FLA基因利用拟南芥蘸花法获得过表达BpFLA拟南芥植株,表型观察结果显示过表达BpFLA的转基因拟南芥植株相对野生型抽茎早,花序茎高,叶片增大。说明这条BpFLA基因受BpNAC012的诱导,具有促进茎发育的功能。以上结果说明BpNAC012的表达,调控了木质部发育及次生细胞壁合成的代谢通路,进而调控白桦木质部的发育。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943
【图文】：

白桦,切片染色,转基因,细胞壁组分

图２－１转基因白桦与对照白桦的切片染色分析逡逑２．２．２转基因白桦细胞壁组分的测定逡逑从表２－１中的数据可以看出，ＢｐＮＡＣ０１２过表达白桦的纤维素含量较野生型的氋，逡逑办见４０？／２抑制表达白桦的半纤维素含量较野生型的低；办况４０？７２过表达白桦的纤维逡逑素含量较野生型的低。逡逑表２－１转基因株系细胞壁组分测定逡逑纤维素（％）逦半纤维素（％）逦木质素（％）逡逑ＷＴ逦４０．７６逦２４．５７逦２６．０５逡逑ＢｐＮＡＣ０１２－ＯＥ逦４４．６１逦２４．８６逦２２．７５逡逑ＢｐＮＡＣ０１２－ＲＳ逦３６．８０逦２２．８８逦２３．９２逡逑２．３讨论逡逑

流程图,文库构建,流程图,样品

分别取３个月苗龄的转基因白桦和野生型白桦儢，去除叶片和根，用于转录组测序逡逑的材料，每个处理三次生物学重复，每次生物学重复５－７株（抑制表达株系茎小，７株逡逑满足建库要求）。文库构建流程图如下（图３－１）：逡逑Ｔｍａｌ邋ＲＮＡ样品检测逡逑逦ｊ逦逡逑逦邋＇Ｗ逦．逦．．逡逑双链ｃＤＸＡ合成逡逑末＿修复邡Ａ和接头逡逑、酬卿卿卿，＂丨哪■，明卿．廔[鏡[—一逡逑片段选择和ＰＣＲ富集逡逑逦逦逦逦Ｖ邋逦邋．逡逑文厍质置检测逡逑逦邋Ｖ逡逑Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ逡逑图３－１文库构建流程图逡逑３．１．２邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋样品检测逡逑对ＲＮＡ样品的检测主要包括４种方法：逡逑（１）

【参考文献】