丹参GRAS转录因子家族鉴定及DELLA亚家族基因功能研究

发布时间：2020-06-20 10:43

【摘要】：当植物受到生物或者非生物胁迫时,为了更好的适应环境,在体内瞬时积累大量激素,如脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)等,这些激素会通过信号传导途径调控次生代谢产物的合成和积累。已有研究表明,茉莉酸甲酯(MeJA)、赤霉素(GA3)、水杨酸(SA)等,可以作为外源诱导子促进丹参酚酸类、萜类和黄酮类化合物的合成和积累。DELLA基因(GRAS基因家族成员)作为植物特有的转录因子之一,是环境与激素,激素与激素信号途径之间的联系枢纽,不仅在激素调控网络中发挥着重要的作用,同时还参与了植物次生代谢产物的合成。SmDELLA基因功能的阐述对于研究丹参次生代谢途径调控机制具有重要意义。因此,本课题选择丹参SmDELLA基因为研究对象,试图通过生物信息学分析、表达模式分析结果等,结合基因工程技术对丹参SmDELLA基因功能进行研究和阐述。本研究的主要结果及结论如下:1.在丹参中,共鉴定出34个GRAS基因家族成员,发现所有丹参GRAS蛋白的C端都具有典型的GRAS结构域。通过与拟南芥GRAS蛋白进行系统进化分析,结果表明:丹参SmGRAS基因共分为11个亚家族;研究发现丹参SmGRAS基因家族成员的基因结构及蛋白序列基序分析结果与系统进化树分析结果具有一致性。为了深入研究丹参SmGRAS基因的功能,首先对SmGRAS基因启动子序列的顺式作用元件进行分析,发现SmGRAS基因家族成员普遍都具有茉莉酸甲酯(MeJA),赤霉素(GAs)以及水杨酸(SA)等响应元件;分析丹参SmGRAS基因在各组织器官以及在茉莉酸甲酯(MeJA),赤霉素(GA3)和水杨酸(SA)激素处理条件下的基因表达情况,实验结果表明:共有5个SmGRAS基因可能调控丹参次生代谢合成途径。2.本研究克隆了 4条SmDELLA基因,并利用Gateway技术构建绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达载体pEarleyGate103-SmDELLA,利用基因枪瞬时转染洋葱表皮法,观察SmDELLA蛋白在细胞内的核定位情况,实验结果表明:丹参SmDELLA蛋白主要定位在细胞核中。3.利用Gateway技术构建酵母表达载体pGBKT7-GW(BD)-SmDELLA,并验证4个SmDELLA蛋白的毒性以及是否存在自激活作用,实验结果表明:丹参4个SmDELLA蛋白对酵母AH109菌株均无毒性;丹参SmDELLA1蛋白无自激活作用,SmDELLA2-3蛋白具有自激活作用,所以选择SmDELLA1蛋白作为酵母双杂交实验研究对象,酵母双杂交实验结果表明:SmDELLA1与SmJAZs,SmMYC2存在相互作用,与拟南芥中结果具有相似性;但是SmDELLA1还可以与丹参酚酸类物质合成信号途径的负调控因子SmMYB36存在相互作用,这一结果暗示SmDELLA1可能调控丹参酚酸类物质合成的信号途径。4.为进一步研究丹参4条SmDELLA基因的功能,利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法转染丹参叶片,经DNA及RNA水平的检测,选择干涉效果明显的株系作为后续实验研究株系,具体株系名称如下:D1-R1,D1-R8,D2-R3,D2-R4,D3-R2,D3-R3,D4-R1。并检测以上SmDELLA基因干涉株系中的总酚酸和总黄酮含量,结果表明SmDELLA基因干涉株系中的总酚酸和总黄酮含量与野生型株系(WT)相比均呈现降低趋势,因此初步推测SmDELLA基因可能是丹参总酚酸和总黄酮生物合成途径中的正调控因子。
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S567.53
【图文】：

内含子,丹参,基因结构,外显子

舱碌げ危牵遥粒踊饷蚣易宄稍奔釯缜氨泶锬Ｊ椒治觯]3?如图２－２所示，研究发现丹参基因包含的内含子个数包括０－３个不等，逡逑所以认为５＞ｗＧ基因结构差异较大，我们发现大多数丹参ＧＲＡＳ基因均为单外逡逑显子，其中有２４个基因无内含子，７个基因（}0Ｇ兄＾９，逦从逡逑ＳｗＧ兄４５２２，邋ＳｗＧ兄４５７７，邋５ＶＭＧ／ＭＳ２９，邋ＳｗＧ似幻３）含有１个内含子（分布于ＩＩ，ＩＶ，逡逑Ｘ，ＸＩ亚家族），包含有２个以上内含子的基因包括：ＳｗＧ兄１Ｓ５，逦和逡逑■ＳｍＧ似幻２。其中，包含内含子个数最多的基因为５＞？ｉＧ／＾Ｓ５和ＳｍＧ兄４５２＆其包逡逑含的内含子个数为３个。由于丹参ＧＲＡＳ基因结构既存在相似性（含有相同数目逡逑的外显子）

基因家族,丹参,成员,基序

陕西师范大学硕士学位论文逡逑２．５．４丹参ＧＲＡＳ基因家族保守基序分析逡逑在丹参ＧＲＡＳ基因家族中共鉴定出了邋１４个保守基序（详见图２－３，表２－２），逡逑凡基因家族中的ＸＩ亚家族包含的基序种类最多，为１４个；然而，NB逡逑基因中包含的保守基序种类最少，为４个。结合图２－３和表２－２分析，我们发现丹逡逑参ＧＲＡＳ基因家族的系统进化分析在一定程度上与图２－１具有一致性；另外，丹逡逑参ＧＲＡＳ基因中每个亚家族所包含的基序数量也不尽相同，保守基序也在一定程逡逑度上反应了丹参ＧＲＡＳ基因家族在进化过程中的结构特点

【参考文献】