Beclin-1基因沉默对前列腺增生上皮细胞BPH-1自噬及凋亡作用机制的研究

发布时间：2020-06-21 13:59

【摘要】：实验目的:前期研究发现单一的去雄(AD)或自噬抑制(AI)都能促进BPH-1细胞的凋亡,共同作用后凋亡进一步加强,在第24H时自噬和凋亡呈现拮抗关系。本实验将在去雄且自噬抑制条件下,研究沉默Beclin-1基因对BPH-1细胞自噬水平及凋亡水平的影响,研究沉默Beclin-1基因对AKT凋亡通道的调节,从细胞自噬和细胞凋亡角度去探索前列腺增生。研究方法:实验包括正常细胞组、空载体细胞组(sh-RNA)、低表达sh-Beclin-1细胞组三组。首先通过克隆构建、慢病毒包装、慢病毒感染及嘌呤霉素筛选获得携带空载体BPH-1细胞系(sh-RNA),低表达Beclin-1的BPH-1细胞系(sh-Beclin-1),并采用western blot和qRT-PCR验证转染效率。构建LC3细胞自噬腺病毒Adv-LC3-GFP,将正常细胞、空载体细胞(sh-RNA)、sh-Beclin-1细胞培养过夜使细胞贴壁(8-12小时),感染LC3细胞自噬腺病毒48小时,拍照观察;清除培养基,PBS清洗三次,将各组细胞于含有10%Charcoal-stripped FBS、50μM chloroquine的培养基中培养24小时(Phenol Red-free),拍照观察。将正常细胞、空载体细胞(sh-RNA)、低表达sh-Beclin-1细胞培养过夜并使细胞贴壁(8-12小时),PBS清洗三次,再将细胞于含有10%Charcoal-stripped FBS、50μM chloroquine的培养基中培养24小时(Phenol Red-free),通过Flow Cytometry法检测各组细胞的凋亡水平,提取各实验组细胞总蛋白,并通过western blot检测LC3Ⅱ、PARP-1、Caspase-3、BAX、BCL-2、AKT、P-AKT、m-TOR、β-actin蛋白表达情况。实验结果:(1)western blot、qRT-PCR方法检测正常对照组、sh-RNA-BPH-1组、sh-Beclin1-BPH-1组Beclin-1蛋白及RNA表达结果显示:正常对照组、sh-RNA-BPH-1组Beclin-1蛋白及RNA表达无差异,sh-Beclin1-BPH-1组Beclin-1蛋白及RNA表达则明显降低。(2)感染LC3细胞自噬腺病毒48小时,拍照观察,sh-Beclin-1组与正常对照组、sh-RNA-BPH-1组相比GFP-LC3表达明显下调(P0.001),用含有10%Charcoal-stripped FBS、50μM chloroquine的培养基培养24小时(Phenol Red-free),荧光显微镜观察到sh-Beclin1组较正常对照组、sh-RNA组荧光点数明显减少(P0.001)。(3)各组细胞培养过夜,用含有10%Charcoal-stripped FBS、50μM chloroquine的培养基培养24小时(Phenol Red-free),采用Flow Cytometry法检测各组细胞凋亡水平,发现sh-Beclin1-BPH-1组细胞凋亡率较正常对照组、sh-RNA-BPH-1组明显升高(P0.01)。(4)western blot检测各组相关蛋白表达水平,sh-Beclin1-BPH-1组中LC3Ⅱ蛋白表达水平较正常细胞组、sh-RNA组明显下调;(5)sh-Beclin1-BPH-1组PARP-1蛋白表达水平下降并产生裂解片段、Caspase-3蛋白表达水平下调;(6)sh-Beclin1-BPH-1组BCL-2表达下调并BAX蛋白表达上调、BCL2/BAX比值降低;(7)正常对照组、sh-RNA-BPH-1组、sh-Beclin1-BPH-1三组中蛋白AKT表达无明显差异,但sh-Beclin1-BPH-1组P-AKT较前两组表达则明显降低,且m-TOR蛋白的表达则明显上调。实验结论:Chloroquine能有效的抑制BPH-1细胞的自噬程度;在去雄且自噬抑制条件下,沉默Beclin-1基因可以进一步降低前列腺增生上皮细胞BPH-1的自噬强度,并活化PARP-1、Caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡诱导蛋白,通过Akt凋亡信号通道促进BPH-1细胞的凋亡;
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R697.3
【图文】：

自噬,细胞,自噬体,溶酶体

胞内的受损的细胞器或者某些大分子物质而产生自噬体，自噬体的形成能够分别否产生；自噬小体进一步与溶酶体结合形成“自噬-溶酶体”（图 1），溶酶体内的白酶则会分解自噬体内的物质，形成氨基酸、游离脂质、糖类等物质为细胞供应，所以在多数情况下自噬对于细胞而言是一种保护机制，但细胞自噬也可以诱导药性得出产生以及促肿瘤细胞生长。

自噬,雷帕霉素,前列腺增生,类属

图 2 Beclin-1 与 PI3K-AKT-mTOR 通路的关系-TOR 是一种 Ser/Thr 蛋白激酶，类属 PIKK 家族[34]，对于哺乳动物而言，m-T在 mTORC1 和 mTORC2 两种复合物形态[35]，m-TOR 联系着多个信号通路，枢纽的功能，通过对不同信号的识别和整理对糖类、脂肪、蛋白质的代谢，以增殖、分化等生命活动密切相关。PI3K-Akt-mTOR 通道主要经过对 m-TOR控制自噬，m-TOR 也是自噬初期的首要调控蛋白，对自噬有负调控功能[36]，长因子信号调控下，PI3K-AKT 与 Tyr 激酶受体杂合，活化后的 m-TOR 下调能AKT 可以激活 mTORC1 与 mTORC2，其中 mTORC1 的激活在能量充沛的溶面产生[38]，mTORC2 则对雷帕霉素并不具敏感性[39]，但激活的 mTORC2 可以挥正性调控并保存细胞[40]。该通道调控多种疾病的发生、进展，本研究将以基因Beclin-1为研究对象去探索该基因对前列腺增生上皮细胞和对该通路的作。

【参考文献】