荞麦MATE基因的克隆与表达分析

发布时间：2020-06-21 21:34

【摘要】：多药物和有毒化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family,MATE)是生物中5类解毒输出转运蛋白家族之一,成员分布广泛,遍及古细菌、细菌、酵母、动物和植物。目前,研究发现的植物中MATE型转运蛋白的转运底物有烟碱、原花青素、花青素、柠檬酸盐、脱落酸等,主要功能为次生代谢物的积累、重金属转运和激素信号转导等。原花青素(proanthocyanidins,PAs),也叫缩合单宁,是植物酚类物质中普遍存在的组分之一,呈现出多样的生物和生物化学活性,并对人体健康有潜在的有益作用。荞麦(Fagopyrum esculentum)属于蓼科荞麦属植物,是一种具有很高食用价值和医疗保健作用的经济作物,也是一种极具开发潜力的功能性食品原料。荞麦有两个常用栽培种:甜荞麦和苦荞麦。世界上其他国家栽培的荞麦大部分都为甜荞,中国是世界上唯一大面积栽培苦荞的国家,面积和产量均居世界第一。苦荞由于比甜荞含有更多的黄酮类化合物而备受关注。前期荞麦种子转录组测序结果显示,MATE注释的unigene共有54条,但对这些基因的研究报道极少,只有LEI等在荞麦中发现2个MATE基因,并通过对其编码蛋白--FeMATE1和FeMATE2的功能分析,得出两者与荞麦解除Al离子胁迫相关。基于以上报道,本研究(1)采用RACE克隆技术获得2条(Fett12和Femate3)荞麦MATE基因的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析;(2)完成了荞麦Fett12基因的克隆、测序,及其在甜荞和苦荞不同部位和种子不同发育阶段的表达模式;(3)运用分光光度法和HPLC法测定了甜荞与苦荞不同发育阶段花和种子中的原花青素、芦丁和儿茶素含量;(4)构建FeTT12真核表达载体,研究其在烟草中的亚细胞定位。主要结果如下:提取荞麦RNA,RACE克隆,获得了2条MATE全长cDNA序列。通过ExPASy中的protparam在线分析和构建系统进化树得知,其中1条编码一个含有492个氨基酸残基的蛋白,其分子量为53.81 kD,等电点为6.75,属于原花青素MATE转运蛋白,将其命名为Fett12(GenBankAccession No.MG515589)。将FeTT12氨基酸序列与其他植物TT12的氨基酸序列进行比对和同源分析,结果表明,FeTT12与MnTT12同源性最高,为77.3%;与拟南芥TT12同源性最低,为41.5%。另一条编码一个含有516个氨基酸残基的蛋白,分子量为56.12 kD,等电点为6.52,属于柠檬酸盐MATE转运蛋白,将其与之前报道的荞麦FeMATE2蛋白和其他物种中转运柠檬酸盐的MATE蛋白进行多序列比对及同源分析,发现其与Al离子胁迫相关的荞麦MATE蛋白FeMATE2的同源性达到96.33%;与其他柠檬酸盐转运MATE蛋白的同源性也在59%以上;因此,将其命名为Femate3(GenBankAccession No.MG515590)。Fett12基因克隆、测序结果表明:该基因的编码区全长2396 bp,由8个外显子、7个内含子组成,内含子的剪切方式均符合GT-AG剪切规律。通过与拟南芥和蒺藜苜蓿tt12的基因进行比较,得到它们的内含子外显子数量一致。荧光定量-PCR结果表明:Fett12基因的表达具有明显的时空特异性,且在荞麦叶片中的表达量最高。在甜荞与苦荞种子的不同发育阶段,Fett12的表达模式亦有差异,伴随着种子不断发育成熟,Fett12基因在苦荞种子中的表达模式呈现先升高后降低的趋势,在甜荞种子中的表达模式为逐渐升高。荞麦中,原花青素、芦丁和儿茶素作为次级代谢产物,其分布具有明显的组织器官差异。对于甜荞,原花青素在花中的含量最高;对于苦荞,原花青素在发育初期的种子中含量最高;芦丁和儿茶素均是花中含量高于种子。成熟期种子中,三种化合物在苦荞中的含量均高于甜荞,且基本都是在灌浆期(21DPA)与甜荞拉开差距。其中成熟期种子中,苦荞芦丁的含量是甜荞的16倍,原花青素的含量是甜荞的3倍。在甜荞花苞、花及种子不同发育阶段,三种化合物的含量均在花中最高。烟草亚细胞定位:成功构建了荞麦FeTT12的真核表达载体,激光共聚焦观察到FeTT12定位于膜上。本研究通过分析荞麦MATE基因的克隆与表达为MATE型转运蛋白成员在荞麦中的功能研究提供基础。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S517;Q943.2
【图文】：

系统发育树,多药,家族

内外的化学物质以及信号交换。根据转运能量的来源不同，可以将转运蛋白分为初级转运蛋白和次级转运蛋白。初级转运蛋白的能量来源主要为 ATP 水解、光子吸收、电子流、底物脱羧或甲基转移反应等过程释放的能量[1-2]，典型代表为 ATP 结合盒（ATP binding cassette,ABC）超家族；而次级转运蛋白的能量来源则是利用物质在膜内外浓度不同造成的电化学渗透势能来转运底物[3-4]，典型代表为多药物和有毒化合物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion family，MATE）。1.1.2 MATE 基因家族概述MATE 蛋白作为生物中 5 类解毒输出转运蛋白家族之一，成员分布广泛，遍及古细菌、细菌、酵母、动物和植物[5]。通过已知的 MATE 转运蛋白系统发育研究（图1.1），MATE 家族存在 3 个大簇和 14 个小簇[6-8]：第 1 簇为细菌多药外排蛋白；第2 簇由真核生物组成，来源于真菌、植物、动物、原生动物等；第 3 簇为存在于细菌和原始细菌中的 MATE 转运蛋白。所有的 MATE 转运蛋白虽没有明显的共有保守序列，但多数成员之间都具有大约 40%的序列相似性。

组织特异性,生理作用,基因表达,植物

图 1.2 植物中 MATE 基因表达的组织特异性和生理作用图[20]Fig 1.2 Expression and Physiological of MATE Gene in Plants[20]1.2 黄酮类化合物1.2.1 黄酮类化合物概述黄酮类化合物在结构上有共同的三环化学结构（C6-C3-C6），属于多酚类物质，主要类别有黄酮、花青素、黄酮醇、黄烷醇和原花青素或缩合单宁[26]。作为次级代谢产物，这些化合物的含量和分布根据植物种类、器官、发育阶段和生长条件的不同而具有明显差异[27]。黄酮类化合物在植物中具有广泛的作用，如抗氧化活性，紫外线保护和防御植物病原体（例如，在豆类植物中起植物抗毒素作用的异黄酮），豆科植物结瘤，雄性能育，视觉信号和生长素运输控制等[28]。1.2.2 原花青素原花青素（Proanthocyanidins，PAs），也称为缩合单宁，是一组天然存在于多

【参考文献】