松材线虫3条效应因子基因克隆

发布时间：2020-06-21 22:30

【摘要】：松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)传入我国已有三十多年,由松材线虫引起的松树萎蔫病(Pine Wilt Disease,PWD)严重破坏我国森林生态系统,造成了不可估量的损失。至今仍未找到有效防治松材线虫的方法,松材线虫新的疫区仍在不断增加,且各种证据表明疫区有由气候温暖的南方逐渐向寒冷的北方扩散的趋势,最北已达到辽宁省大连市等地。松材线虫难以防治与其发病特点相关,病害发生初期没有明显的特征不易被发现,且其病害传播、病情发展极为迅速,当出现明显症状时疫情已经难以控制。松材线虫在与寄主植物互作过程中,通过产生效应因子破坏寄主防御系统,并在寄主体内快速繁殖蔓延直至寄主死亡。因此,通过对与致病性相关的松材线虫效应因子进行研究,为揭示松材线虫的致病机理提供理论依据。虽然早已完成基因组测序,但由于寄生策略与其他植物线虫不同,松材线虫仅找到少量效应因子的同源基因。本试验通过提取接种松树后回收的松材线虫总RNA,构建了 15个转录组文库,对其进行测序并分析差异表达基因,再经共表达及GO富集分析筛选出松材线虫候选效应因子并对其中3条候选效应因子基因进行功能分析及验证。试验所用线虫是由东北林业大学森林保护系线虫菌物实验室提供的松材线虫虫株Bx2044和拟松材线虫虫株Bm0617,及中国林业科学院提供的松材线虫虫株Bx1022。为探究这3个线虫虫株的致病性强弱,选取黑松(Pinus.thunbrgii)、马尾松(P.massoniana)及樟子松(P.sylvestris var.mongolic)作为寄主进行接种试验。将Bx1022、Bx2044和Bm0617分别接种于黑松、马尾松及樟子松,计算感病指数并对线虫在寄主体内繁殖量进行分析。结果表明其中Bx1022对黑松、马尾松和樟子松致病性最强且黑松对其最为感病,接种1d与23 d是产生大量的效应因子的两个时间点,而黑松和马尾松对松材线虫较为感病且互作关系明显,因此选取Bx1022接种黑松和马尾松后1d与23 d这里两个时间点回收线虫并提取线虫总RNA为接种组,以无菌水浸泡2 h的Bx1022的总RNA作为CK组进行转录组测序。通过对接种组和CK组转录组的基因表达量比较,从15个转录组中总共检测到17747个基因表达,根据差异显著表达分析(t-text,n=3)结果,其中Pm-Bx1022-1d中有10852个基因差异表达不显著,6895个基因差异表达显著;Pm-Bx1022-23d中有9522个基因差异表达不显著,有8225个基因差异表达显著;Pt-Bx1022-1d中有10924个基因基因差异表达不显著,有6823个基因差异表达显著;Pt-Bx1022-23d中有8273个基因差异表达不显著,9474个基因基因差异表达显著。经共表达分析结果显示共1357个基因在两种树种两个时间点表现出共性,其中606条基因2树种2个时间点表达量均显著上调,751条基因表达量均显著下调。GO富集分析及跨膜结构域分析选取Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9为松材线虫候选效应因子,并进行基因克隆及功能分析。为进一步验证候选效应因子,对Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9进行基因克隆后由原位杂交试验及RNAi试验进行基因功能分析。原位杂交试验结果显示,Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因在均在松材线虫食道腺上表达。线虫效应因子分泌部位在食道腺、性腺和侧尾腺等器官上,其中食道腺为主要分泌器官,因此原位杂交试验结果表明该3个候选效应因子分泌部位符合线虫效应因子的分泌部位。为进一步验证其基因功能进行了 RNAi试验,结果表明经RNAi处理后的松材线虫相应基因表达量下调。将Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9分别沉默后,以正常培养的Bx1022作为试验对照与无菌水作为空白对照,RNAi-Ef1、RNAi-Ef3和RNAi-Ef9为RNAi试验组对黑松进行接种试验,结果显示RNAi试验组黑松出现症状时间远远晚于试验对照组,甚至在试验对照组已出现死亡的情况下才开始出现症状。表明将Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因分别单独沉默后,均对松材线虫的致病性产生了影响。经试验验证,Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因这3条基因的功能与线虫致病性相关。根据症状出现时间与枯萎死亡时间,得出RNAi后对黑松致病性:RNAi-Ef3RNAi-Ef9RNAi-Ef1,表明各基因对线虫致病性的影响:Bx-Ef1Bx-Ef9Bx-Ef3。通过以上试验结果证明,Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因无论表达部位还是基因功能都符合线虫效应因子的应有特征,因此鉴定这3条基因为效应因子。通过Q-PCR试验检测Bx1022和Bx2044分别接种黑松、马尾松和樟子松23 d后Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因相应的表达量,试验结果显示Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因均表现为在Pm-Bx2044-23d和Ps-Bx1022-23d表达量无明显变化(-1log21),其余表现为明显上调(log21),其中Bx-Ef1表达量上调最多。结果表明这3条基因的表达量和线虫的致病性正相关。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S763.18
【图文】：

图２－３黑松接种线虫后的症状图逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｆｉｇｕｒｅ邋ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋ｎｅｍａｔｏｄｅｓ邋ｏｆ邋Ｐ．邋ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ逡逑图为黑松（Ｐｔ）接种Ｂｘｌ０２２、Ｂｘ２０４４、Ｂｍ０６１７和无菌水（ＣＫ）后Ｉｄ、各松树出现症状时间点（７ｄ、９ｄ、１１逡逑ｄ、１３ｄ邋和邋１５ｄ）和邋２９ｄ逡逑

２线虫致病性研宄逡逑Ｐｍ－ＣＫ：至观察结束，一直处于健康，水分充足状态。逡逑分别接种３个线虫虫株后，樟子松茎段变化情况（图２－８）：逡逑Ｐｔ－－Ｂｘｌ０２２：邋１３邋ｄ茎段开始褐变，随后逐渐变干，变硬；逡逑Ｐｔ－Ｂｍ０６１７：邋ｌｉｄ茎段开始褐变，随后逐渐变干，变硬；逡逑Ｐｔ－Ｂｘ２０４４：邋１７ｄ茎段开始褐变，随后逐渐变干，变硬；逡逑Ｐｔ－ＣＫ：至观察结束，一直处于健康，水分充足状态。逡逑分别接种３个线虫虫株后，黑松茎段变化情况（图２－９）：逡逑Ｐｓ－Ｂｘｌ０２２：邋９ｄ茎段开始褐变，随后逐渐变干，变硬；逡逑Ｐｓ－Ｂｍ０６１７：邋１５ｄ茎段开始褐变，随后逐渐变干，变硬；逡逑Ｐｓ－Ｂｘ２０４４：邋１３邋ｄ茎段开始褐变

【参考文献】

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1 林孝春;;松材线虫病的危害及防控措施综述[J];华东森林经理;2015年03期

2 陈凤毛;史延梅;王姝颖;汤坚;孙翠云;叶建仁;;不同株系拟松材线虫对黄山松和黑松苗木的致病性[J];林业科学;2010年12期

3 林森;;国家林业局发出通知坚决遏制林业有害生物传播蔓延[J];农药市场信息;2007年21期

4 李新贵;贵州省拟松材线虫病的风险性分析[J];西部林业科学;2005年03期

5 李东方;;国家林业局公布最新松材线虫病疫区[J];农药市场信息;2005年06期

6 张治宇,林茂松,余本渊;拟松材线虫对黑松苗的致病性[J];南京农业大学学报;2004年01期

7 李新贵,孔志红,林皎,陈登;黔灵公园马尾松枯死原因的初步调查[J];贵州林业科技;2002年03期

8 黄悦悦,任泽君,曹红珍,李振华,钱中;德兴市马尾松枯死树中的拟松材线虫致病性测定[J];江西林业科技;1999年01期

9 姚晓华;江西省拟松材线虫分布简报[J];江西林业科技;1996年01期

10 方光明;拟松材线虫导致马尾松萎蔫[J];江西林业科技;1996年01期

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1 张兴华;拟松材线虫体表微生物及其致病作用研究[D];四川农业大学;2009年

本文编号：2724740