miR-1250及其宿主基因AATK在食管鳞状细胞癌中的作用及甲基化状态研究

发布时间：2020-06-22 11:17

【摘要】：第一部分miR-1250及其宿主基因AATK在食管鳞状细胞癌中的作用及其甲基化状态目的:研究miR-1250和细胞凋亡关联酪氨酸激酶(apoptosis-associated tyrosine kinase,AATK)在食管癌细胞系及食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中的表达情况及甲基化状态,并分析其表达和甲基化状态与患者临床病理特征之间的关系。探讨mi R-1250及其宿主基因AATK在ESCC发生、发展中的作用。方法:1应用实时荧光定量反转录多聚核苷酸酶链式反应(Quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)的方法分别检测miR-1250和AATK的mRNA在DNA甲基化转移酶抑制剂5-Aza-d C处理前后的食管癌细胞系以及ESCC组织及其相应癌旁正常组织中的表达情况。2应用免疫印迹试验(Western Blot,WB)检测在5-Aza-dC处理前后的食管癌细胞系中AATK蛋白的表达情况。3应用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)SP法检测ESCC组织及其相应癌旁正常组织中AATK蛋白的表达情况。4应用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation specific polymerase chain reaction,MSP)的方法分别检测AATK在5-Aza-dC处理前后的食管癌细胞系以及ESCC组织及其相应癌旁正常组织中的甲基化状态。结果:1.mi R-1250和AATK在食管癌细胞系中的表达情况及甲基化状态:mi R-1250和AATK在5-Aza-dC处理后的4株食管癌细胞系(Eca109、TE1、Yes-2、T.TN)中的表达均显著上调;AATK在5-Aza-dC处理后的4株食管癌细胞系中甲基化程度均明显降低(P0.05)。2.mi R-1250和AATK的mRNA在ESCC组织中的表达情况:mi R-1250和AATK在ESCC组织中的相对表达量显著低于其相应癌旁正常组织(P0.05),并且与淋巴结转移、分化程度和TNM分期相关(P均0.05),与性别、年龄无关(P均0.05)。3.AATK蛋白在ESCC组织及其相应癌旁正常组织中的表达情况:AATK蛋白在ESCC组织中的表达阳性率显著低于其相应癌旁正常组织(P0.05),并且与分化程度和TNM分期相关(P均0.05),与淋巴结转移、性别和年龄无关(P均0.05)。4.AATK在ESCC组织及其相应癌旁正常组织中的甲基化状态:AATK在ESCC组织中的甲基化率显著高于其相应癌旁正常组织(P0.05),并且与淋巴结转移、分化程度和TNM分期相关(P均0.05),与性别、年龄无关(P均0.05)。5.mi R-1250、AATK的表达与甲基化间的相关性分析:1)在ESCC组织中mi R-1250和AATK的mRNA表达之间呈明显正相关(P0.05)。2)AATK的mRNA表达在其蛋白表达阳性的ESCC组织中显著高于其蛋白表达阴性的ESCC组织(P0.05)。3)miR-1250在发生甲基化的ESCC组织中的表达明显低于未发生甲基化的ESCC组织(P0.05)。4)AATK在发生甲基化的ESCC组织中的mRNA表达显著低于未发生甲基化的ESCC组织(P0.05)。5)AATK蛋白在发生甲基化的ESC组织中的表达显著低于未发生甲基化的ESCC组织(P0.05)。第二部分miR-1250在食管癌细胞中的生物学功能目的:研究过表达mi R-1250后,食管癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的改变。方法:1在Eca109细胞中转染miR-1250的mimics,并通过qRT-PCR的方法检测转染效率。2应用MTS、克隆形成实验检测过表达miR-1250后对食管癌细胞增殖能力的影响。3应用划痕实验检测过表达miR-1250后对食管癌细胞迁移能力的影响。4应用Transwell小室侵袭实验检测过表达miR-1250后对食管癌细胞侵袭能力的影响。结果:1.在Eca109细胞中过表达miR-1250后的转染情况:在Eca109细胞中成功过表达mi R-1250,miR-1250在转染组细胞中表达均显著高于对照组的Eca109细胞(P0.05)。2.过表达miR-1250后对食管癌细胞增殖能力的影响:MTS和克隆形成实验结果显示,过表达mi R-1250能够显著抑制Eca109细胞的增殖活性(P0.05)。3.过表达miR-1250后对食管癌细胞迁移能力的影响:划痕实验结果显示,过表达miR-1250能够显著抑制Eca109细胞的迁移能力(P0.05)。4.过表达miR-1250后对食管癌细胞侵袭能力的影响:Transwell小室侵袭实验结果显示,过表达mi R-1250能够显著抑制Eca109细胞的侵袭能力(P0.05)。结论:1.食管鳞癌中miR-1250与其宿主基因AATK的表达具有一致性,且它们的表达降低与食管鳞癌患者的分化程度和TNM分期密切相关,提示AATK可能是miR-1250的宿主基因,并且两者在食管鳞癌中可能作为抑癌基因,且它们的失活与食管鳞癌的侵袭转移有关。2.启动子区异常高甲基化可能是miR-1250及AATK在食管鳞癌中表达沉默的重要机制之一。3.过表达miR-1250后食管癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力受到抑制,进一步提示mi R-1250与食管鳞癌的侵袭转移相关。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1
【图文】：

引物,基因,鳞癌,食管

图 1AATK 基因 CpG 岛分布及 MSP 引物位置Fig.1 CpG islands distribution ofAATK and location of MSP pri: Blue region: Position of CpG islands (-524~-293,-265~254); →←ion of MSP primer; +1: Transcription initiation site图 2 食管正常组织与鳞癌组织 HE 染色（200×）

鳞癌,食管,HE染色,正常组织

研究论文附图图 1AATK 基因 CpG 岛分布及 MSP 引物位置Fig.1 CpG islands distribution ofAATK and location of MSP primerNote: Blue region: Position of CpG islands (-524~-293,-265~254); →←: Thelocation of MSP primer; +1: Transcription initiation site

【参考文献】