受hTERT启动子调控的Noxa和Puma基因诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

发布时间：2020-06-23 06:14

【摘要】：原发性肝癌(primary liver cancer,PLC,以下简称肝癌)作为一种恶性肿瘤,对人们的身体健康和生活质量有着严重的威胁。肝癌是全球第六大癌症,亦位居我国癌症中的第二位,全球50%以上的肝癌都发生在我国。手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、生物治疗、中医中药治疗等是目前治疗肝癌的主要临床方法,但肝癌作为一种有高侵袭性的恶性肿瘤,早期症状不明显,患者一经诊断往往已属于晚期,因此目前肝癌的治疗效果和整体预后仍然很差。近年来,随着对分子生物学和肿瘤学研究的不断深入,选择分子靶向性治疗肿瘤的方法成为了一种新的理想策略。细胞凋亡是一种由多种基因共同调控的细胞程序性死亡过程,通过激活肿瘤细胞凋亡途径可成为治疗肿瘤的一种方式。Bcl-2蛋白家族对细胞的凋亡进程起着调控作用。近年来发现的Noxa与Puma蛋白同属于Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白亚家族BH3-only蛋白家族中的两种促凋亡蛋白,具有较强的促凋亡作用。端粒酶是目前已知的最广谱的肿瘤标志物,人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRET)是端粒酶的组成部分之一,并是端粒酶激活的关键限速步骤。hTERT在正常细胞中表达量很低,而在肿瘤细胞中表达量很高,在hTERT转录起始位点上游具有多个转录因子的结合位点,提示hTERT启动子不仅具有肿瘤靶向性,并且具有较强的启动活性,可以使基因高表达。因此,本实验拟研究受hTERT启动子调控的Noxa和Puma基因对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响及其潜在的分子机制。实验目的:探讨pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma两种真核表达质粒对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响及其潜在分子机制实验方法:(1)细胞增殖分析:两种重组真核表达质粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma分别转染HepG2细胞24h、48h、72h后,通过以下实验分析细胞增殖情况:(1)细胞形态观察:于光学显微镜下观察转染后HepG2细胞形态变化;(2)CCK-8法分析转染后HepG2细胞的生存率。(2)细胞凋亡分析:两种重组真核表达质粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma分别转染HepG2细胞后,通过以下实验分析细胞凋亡情况:(1)Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态和分析细胞凋亡率;(2)Annexin V-FITC分析转染后细胞凋亡率;(3)Real-time PCR检测凋亡相关基因bcl-2、bax、mcl-1、bcl2A1的mRNA表达水平;(4)Western-blot分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9的表达水平。(3)细胞迁移与侵袭性分析:两种重组真核表达质粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma分别转染HepG2细胞后,通过以下实验分析细胞的迁移和侵袭能力:(1)克隆形成实验;(2)细胞划痕实验;(3)Transwell小室实验;(4)Real-time PCR检测迁移侵袭相关基因mmp-9的mRNA表达水平。(4)两种重组真核表达质粒的肿瘤细胞靶向性初步分析:将两种重组真核表达质粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma分别转染人肝癌HepG2细胞和人正常肝细胞HL7702细胞后,利用CCK-8法分析两种细胞生存率变化。实验结果:(1)重组质粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma明显抑制HepG2细胞增殖。首先于光学显微镜下观察,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma组与空白组和阴性对照组相比,呈现出细胞发生皱缩、变圆、内部颗粒物增多、脱落细胞数增多等凋亡细胞的典型特征,且随时间的延长而逐渐加剧。CCK-8法检测细胞生存率结果显示,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma和pcTERT组相比,细胞生存率显著下降,且呈时间依赖性。转染后72h,两组细胞生存率均下降30%左右。同时,在各时间点pcTERT-Puma组细胞生存率均略低于pcTERT-Noxa组。(2)重组质粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma明显促进HepG2细胞凋亡:(1)Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察,pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma组出现较多的凋亡细胞。初步计算细胞凋亡率,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma组与阴性对照pc TERT组细胞凋亡率分别为(31.09±3.87)%、(34.87±3.23)%和(15.92±2.9)%(P0.05);(2)Annexin V-FITC结果显示,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma质粒转染HepG2细胞72h后,细胞凋亡率分别为(29.35±0.64)%和(32.9±0.71)%,显著高于阴性对照pcTERT组(18.67±1.21)%(P0.01),且pcTERT-Puma组细胞凋亡率高于pcTERT-Noxa组;(3)Real-time PCR分析结果显示:在转染HepG2细胞72h后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma组与pcTERT组相比,抗凋亡相关基因bcl-2、mcl-1、bcl2A1 mRNA表达水平显著下降(P0.05),促凋亡基因bax mRNA表达水平显著上升(P0.05);(4)蛋白免疫印迹分析结果显示:在转染HepG2细胞72h后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma组与pcTERT组相比,凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平显著下降(P0.05),Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9的表达水平显著上升(P0.05)。(3)重组质粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma明显抑制HepG2细胞的迁移与侵袭:(1)克隆形成实验结果显示,空白组与对照组形成的细胞克隆数与重组质粒组相比较多,且单个克隆大,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma组克隆形成率与pTRET组相比具有显著性差异;(2)细胞划痕实验结果显示,在制作细胞伤口模型后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma组与pcTERT组相比,随时间延长划痕间距减小趋势很弱,并且出现较多的脱落细胞。且分别在制作细胞伤口模型24、48、72h后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma组与pcTERT组相比,划痕愈合率均具有显著性差异(P0.05);(3)Transwell小室实验结果显示:两种重组质粒分别转染HepG2细胞后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma组附着于下室聚碳酸酯膜的细胞显著低于pcTERT组和空白组;(4)Real-time PCR分析结果显示:在转染HepG2细胞72h后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma组与pcTERT组相比,迁移侵袭相关基因mmp-9的m RNA表达水平显著下降(P0.05)。(4)初步研究重组质粒对肝癌细胞的靶向性作用。CCK-8检测两种重组质粒分别转染正常肝细胞HL7702细胞和肝癌HepG2细胞后的细胞生存率的结果显示,HL7702细胞生存率随时间的延长下降趋势不明显,而HepG2细胞生存率随时间的延长表现出明显的下降趋势,并且在各个时间点HL7702细胞生存率与HepG2细胞相比均具有显著性差异(P0.05)。转染后72h,pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma组HL7702细胞的生存率仅下降20%左右,而转染后HepG2细胞的生存率下降可达50%左右。提示两种重组质粒对肝癌细胞和正常肝细胞的增殖抑制作用具有差异性。实验结论:(1)pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma质粒可诱导人肝癌HepG2细胞发生凋亡,且可抑制人肝癌HepG2细胞的迁移与侵袭。(2)pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma质粒对人肝癌HepG2细胞和人正常肝细胞HL7702细胞的增殖抑制作用具有差异性。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

Noxa 和 pcTERT-Puma 重组和 XbaI 双酶切，获得 966bp h质粒片段I 和 XbaI 双酶切，获得 582bp性质粒片段重组质粒转染后 HepGTERT-Noxa 和 pcTERT-Pum不同时间点的细胞形态。壁生长，形态饱满，有折状态与空白组相似；pcTE，皱缩、变形、出现较多胞仍长势良好，与 48h 相

重组质粒转染后，光镜下HepG2细胞形态（100×）

【参考文献】

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1 高建芝;杜经丽;李佳;姬翔;韦立新;;VEGF相关信号通路在肝癌组织中的表达及临床意义[J];临床与实验病理学杂志;2014年01期

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1 马薇;noxa mRNA及其编码蛋白表达与非小细胞肺癌的相关性研究[D];昆明医学院;2010年

本文编号：2726919