BcFLC1基因点突变延迟乌菜抽薹的分子机理

发布时间：2020-06-23 08:03

【摘要】：抽薹开花是十字花科作物从营养生长转向生殖生长关键阶段。它是内源因素与外界环境共同作用的结果,适期抽薹对于作物适应当地气候至关重要。因环境条件和自身遗传等因素,生产上先期抽薹现象较多,严重影响了作物产量和品质。乌菜是十字花科大白菜的一个变种,极耐低温,以富含维生素C而闻名。作为江淮一带广泛栽培的蔬菜品种,乌菜先期抽薹问题一直困扰着众多种植者,而培育耐抽薹乌菜品种正是解决该问题的有效途径,掌握乌菜抽薹开花的分子机制,对培育耐抽薹品种意义重大。十字花科作物抽薹开花可由多个途径控制,但大部分途径都作用于FLOWERING LOCUS C(FLC)与SHORT VEGETATIVE PAHSE(SVP)基因,FLC基因编码一个MADS-box蛋白,与下游基因启动子结合,是一个成花抑制因子。FLC可与SVP形成蛋白复合体,共同影响下少游FLOWERING LOCUS T(FT)与SUPPERSSOR OF OVEREXPRESSION CONSTANS 1(SOC1)等的表达,进而控制作物的抽薹开花。本实验通过克隆两个乌菜品种W-1(耐抽薹)与W-2(不耐抽薹)的FLC1基因来分析品种间抽薹性状差异的原因,主要研究结果如下:1.成功从乌菜两个品种中克隆出了FLC1基因,经BLAST分析与欧洲油菜FLC1基因相似度最高,命名为BcFLC1-1及BcFLC1-2,两个基因长591bp,共编码196个氨基酸,经预测该基因编码一个MADS盒和K-Box盒;BcFLC1基因内有两个碱基突变,且后一个碱基的突变造成第174位氨基酸突变。成功从两个品种乌菜中克隆出SVP基因,长726 bp,编码241个氨基酸。2.在线预测结果表明BcFLC1基因定位于细胞核内,同时,设计引物成功构建了pBI121-35S::BcFLC1-GFP表达载体,并利用EHA105农杆菌介导转化洋葱表皮细胞,进行亚细胞定位,证实其在细胞内表达。3.通过实时荧光定量技术分析了BcFLC1、SVP、SOC1、FT在乌菜中的时空表达模式,FLC1与SVP基因在同一时期内两个品种间表达量没有明显差异,但SOC1与FT基因表达量差异较大,晚抽薹品种W-1的SOC1与FT基因表达量显著低于不耐抽薹品种W-2。此外,随着时间的增加,FLC1与SVP基因在两个品种内均呈现下降趋势,FT基因与SOC1基因则呈现上升趋势。花期时,FLC1与SVP基因在根及茎组织中表达较高,在叶片、花及蕾中表达量极低;FT与SOC1基因在根系中表达量较低,在花器官中表达极高。4.为了分析基因点突变对FLC1与SVP的互作造成的影响,采用酵母双杂技术,将BcFLC1基因插入pGBKT7载体并转化Y2H Gold酵母菌株,将SVP基因插入pGADT7载体并转化Y187酵母菌株,经检测载体无自激活与自毒现象;酵母双杂结果表明点突变没有完全破坏FLC1与SVP基因之间的互作,但突变导致二者之间的互作程度降低。5.为了分析互作程度的降低对抽薹的影响,设计并成功构建了BcFLC1基因的植物超表达载体pBI121-35S::BcFLC1,利用农杆菌作介导,用花序侵染法成功侵染并筛选得到了35S::BcFLC1-1转基因3个T_0代植株,35S::BcFLC1-2转基因2个T_0代植株;经筛选种植,在T_3代中得到35S::BcFLC1-1株系共计29棵植株,35S::BcFLC1-2株系共计26棵植株,抽薹统计表明35S::BcFLC1-1株系抽薹时间晚且叶片数增多。荧光定量PCR结果显示,与野生型植株相比转基因植株中FT基因与SOC1基因表达量较低,且35S::BcFLC1-1转基因株系中FT与SOC1基因表达量下降十分明显。因此,BcFLC1基因点突变可影响其与SVP基因之间的互作,继而影响到下游成花整合因子FT及SOC1基因的表达量,最终导致植株晚抽薹。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S634
【图文】：

示意图,抽薹开花,拟南芥,示意图

图 1-1 拟南芥中 FLC 调节抽薹开花示意图（引自 Daniel J[71]）Fig. 1-1 Diagram illustrating regulation of FLOWERING LOCUS C(FLC)拟南芥中，SVP 基因也是一个开花网络关键中心基因，在自主途径、GSVP 蛋白与 SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1（SOERING LOCUS T（FT）的启动子区域相关联，并与其中 FLC 结合。在LC 基因与 SVP 基因形成蛋白复合物，以抑制 SOC1 和 FT 基因的花发通子的表达，进而抑制拟南芥开花[72, 73]。VP 在营养生长期间一直与 FLC 在体内相互作用，并且它们的功能是相LC 功能缺失能减弱 SVP 过表达造成的晚花表型，相反，SVP 功能缺失 FLC 过表达造成的晚花表型，SVP 和 FLC 之间的蛋白互作对于抑制是必需的，决定了花卉通路整合子响应各种内源和环境信号的表达[74]。F用酵母双杂证明了 FLC 与 SVP 存在互作，且通过减少 SVP 的积累以减成复合物，可以减弱对 FT 表达的抑制作用。

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图 4-1 乌菜 cDNA 内参基因检测结果Fig. 4-1 Amplification product of Actin注：M，DL2000 Maker; 1, W-1；2, W-2Note: M, DL2000 Maker; 1, W-1; 2, W-2.因克隆果如图 4-2 所示， SVP 基因LAST 分析，与欧洲油菜 (Bra FLC1 基因大小为 591 bp，共LC1 为 21.98 KD，等电点均为大小均为 726 bp，共编码 241

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