RNA干扰沉默PKC-α基因改善暴发性肝衰竭大鼠肾小球滤过率机制的研究

发布时间：2020-06-23 18:44

【摘要】：目的:急性肾损伤(AKI)是暴发性肝衰竭(FHF)患者一种常见的并发症,因合并肾功能及肝功能衰竭,预后极差。其机制尚不完全清楚,可能与血流动力学的改变、肾脏血液灌注不足、交感神经活化和血管活性物质合成增加相关,最终导致肾血管收缩进而引起肾小球滤过率(GFR)显著降低。我们先前的研究证实FHF大鼠伴有肌酐(Cr)的明显上升及1,4,5-trisphosphate 1型受体(IP_3R1)蛋白表达明显增加,其上调时相与血中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、内皮素-1(ET-1)升高时相一致,TNF-α抗体预先阻断后可明显改善肾功能及GFR。该结果说明TNF-α在FHF大鼠GFR减少中起了至关重要的作用。我们另一个研究结果结果揭示TNF-α是通过TNFR1/PC-PLC/PKC-α和TNFR2独立的两条信号通路上调IP_3R1表达的。TNF-α孵育GMCs后检测其对胞浆Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]i)、PKC-α蛋白及mRNA、IP_3R1蛋白及mRNA、SP-1蛋白表达水平及SP-1蛋白与IP_3R1启动子结合程度的影响,探讨TNF-α在其中的作用。设计、合成并筛选针对PKC-α基因的siRNA,观察PKC-α沉默后对TNF-α诱导IP_3R1、PKC-α、SP-1表达及对胞浆Ca~(2+)浓度SP-1蛋白与IP_3R1启动子结合的影响。根据筛选出的siRNA序列包装合成靶向PKC-α的重组慢病毒载体,应用D-氨基半乳糖(D-Gal N)/脂多糖(LPS)构建FHF大鼠AKI模型,检测血清生化学及细胞因子改变。采用微渗泵植入方法,以FITC-Inulin作为标记物测定GFR,并检测肾小球([Ca~(2+)]i)变化及肾脏组织中PKC-α蛋白及mRNA、IP_3R1蛋白及IP_3R1 mRNA表达。进一步明确TNF-α-PKC-α在FHF合并急性肾功能衰竭中的作用及其下游的细胞通路,以及阻断PKC-α对肾功及GFR的改善情况。研究方法1.细胞培养、传代和siRNA-PKC-α转染。大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)细胞复苏、培养、传代5次后,以2×10~5cells/孔铺6孔板,培养过夜,16h后进行siRNA-PKC-α转染。3条siRNA-PKC-α及阴性对照siRNA按2.5μl(50pmol)、5μl(100pmol)及7.5μl(150pmol)分别和与2.5μl,5μl,7.5μl Lipofectamine?RNAi MAX Reagent在0.5ml双无DMEM培养基中混匀后室温孵育15min;六孔板中每孔加双无DMED高糖培养基2ml,再向每孔加入siRNA与Lipofectamine?RNAi MAX Reagent混合液0.5ml。5%CO_2孵箱37℃培养4-6h后将无血清培养基换成含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养48或24小时,收集细胞,分别提取RNA和蛋白。2.Real-time PCR、Western blot方法分别检测PKC-αmRNA及其蛋白的表达。根据表达结果选择最优siRNA序列。3.TNF-α(100mg/ml)分别孵育0、2、4、8、24小时,分别检测TNF-α对PKC-α、IP_3R1 mRNA及蛋白的表达的影响。4.将筛选出的siRNA和阴性对照siRNA分别转入细胞内,检测转染后对TNF-α诱导PKC-α、IP_3R1 mRNA及蛋白的表达的影响。5.将筛选出的siRNA和阴性对照siRNA分别转入细胞内,检测转染后对TNF-α诱导细胞内Ca~(2+)释放增加的影响。6.TNF-α(100mg/ml)分别孵育0、2、4、8、24小时,检测TNF-α对SP-1蛋白表达的影响,同时Ch IP检测SP-1与IP_3R1 promoter结合的情况。7.将筛选出的siRNA和阴性对照siRNA分别转入细胞内,观察敲减PKC-α后对SP-1蛋白表达的影响,Ch IP检测对SP-1与IP_3R1 promoter结合的影响。8.TNF-α(100mg/ml)分别孵育0、2、4、8、24小时,分别检测TNF-α对JNK、p-JNK蛋白表达的影响。9.将筛选出的siRNA和阴性对照siRNA分别转入细胞内,检测转染后对TNF-α诱导JNK、p-JNK蛋白表达的影响。10.应用JNK抑制剂SP600125预处理后观察对SP-1蛋白表达及对IP_3R1 mRNA及蛋白的表达的影响。11.根据siRNA条带筛选结果构建慢病毒重组表达载体。12.验证动物体内慢病毒介导PKC-α基因的敲减效率。尾静脉注入慢病毒重组表达载体LV-sh RNA-PKC-α(NM_001105713.1-siRNA-487)1.0×10~8TU/只,2周后检测肾脏组织PKC-αmRNA及其蛋白的表达,制作肾脏组织冰冻切片,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在组织内的表达,测定慢病毒在大鼠体内PKC-α敲减效率的情况。13.构建FHF合并AKI模型:给药造模前2周,LV-sh RNA-NC组及LV-sh RNA-PKC-α组各10只大鼠,分别尾静脉注射慢病毒空质粒及LV-sh RNA-PKC-α100μl(1×10~8TU/ml),用生理盐水(NS)稀释至500μl。1周后将所有SD大鼠植入充满FITC-Inulin的微渗透泵。2周后所有SD大鼠称重并按不同分组给药,NS组给生理盐水;G/L组、LV-NC组和LV-PKC-α组给D-Gal N(400mg/kg)/LPS(32μg/kg)的生理盐水溶液;给药体积均为2ml/kg。所有大鼠给药后移入代谢笼搜集尿液。14.肝脏组织常规HE染色,光镜下观察肝细胞坏死情况;肾脏组织常规HE染色,光镜下观察肾脏组织结构是否发生改变;电镜下观察肾脏组织结构是否发生改变。15.检测血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、钾离子(K~+)、钠离子(Na~+)及氯离子(Cl~-)及细胞因子(TNF-α和ET-1)。16.应用荧光酶标仪测定血清FITC荧光量,根据公式GFR=R/[Iss]计算GFR,GFR1(ml·min~(-1));GFR2(ml·min~(-1)·kgB W~(-1)),GFR3(ml·min~(-1)·gKB W~(-1)),观察沉默PKC-α对GFR的影响。17.Real-time PCR、Western blot方法检测各组大鼠肾脏组织PKC-α、IP_3R1mRNA及其蛋白的表达情况,研究敲减PKC-α后对肾脏IP_3R1表达的影响。18.分离肾小球,检测各组大鼠肾小球内Ca~(2+)离子浓度变化,研究敲减PKC-α后对肾脏组织细胞内Ca~(2+)离子浓度变化的影响。19.分离肾小球,检测各组大鼠肾小球容积的变化,研究敲减PKC-α后对肾脏组织细胞收缩的影响。20.收集尿液,检测大鼠尿液总蛋白、尿微量白蛋白(MAU/ALB)及N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)表达。结果:1.根据3条siRNA在不同转染条件下mRNA及蛋白敲减效率的不同,选择一条最优序列,并委托上海吉玛制药技术有限公司包装为重组LV-sh RNA-PKC-α慢病毒包装质粒。2.TNF-α处理组IP_3R1 mRNA表达相比0h显著增加,2h到8h IP_3R1mRNA逐渐稳定增加,并于8h达高峰(P0.05)。TNF-α处理组IP_3R1蛋白表达相比0h显著增加,至24h IP_3R1蛋白升高达高峰,统计学有显著性差异(P0.05)。3.TNF-α处理组PKC-αmRNA的表达相比0h显著增加,4h到8h PKC-αmRNA稳定逐渐增加,于8h达高峰并维持高表达至24h(P0.05)。TNF-α处理组PKC-α蛋白的表达相比0h显著增加,2h开始升高,至8h PKC-α蛋白升高达高峰,统计学有显著性差异(P0.05)。4.单纯敲减PKC-α基因对IP_3R1蛋白及mRNA的表达的影响不大,但对比阴性对照转染组TNF-α孵育8h及24h组,PKC-α基因敲减组的IP_3R1mRNA及蛋白的表达明显下降。5.TNF-α诱导细胞内Ca~(2+)释放增加,单纯敲减PKC-α基因对细胞内Ca~(2+)释放没有明显影响,但可明显抑制由TNF-α诱导细胞内Ca~(2+)释放。6.TNF-α处理组SP-1蛋白的表达相比0h显著增加,2h到8h SP-1蛋白逐渐稳定增加,于8h达高峰(P0.05)。TNF-α处理组SP-1蛋白与IP_3R1promoter结合相比0h明显增加,于8h达高峰。7.单纯敲减PKC-α基因对SP-1的表达的影响不大,但可明显抑制由TNF-α诱导的SP-1表达增加。且可以明显抑制SP-1蛋白及与IP_3R1 promoter的结合。8.TNF-α处理组JNK及p-JNK蛋白的表达相比0h显著增加,2h到8h逐渐增加,于8h达高峰,统计学有显著性差异(P0.05)。9.单纯敲减PKC-α对JNK及p-JNK蛋白的表达的影响不大,但可明显著抑制由TNF-α诱导的JNK及p-JNK蛋白表达增加。10.SP600125预处理后可显著抑制TNF-α诱导的SP-1蛋白及IP_3R1mRNA及蛋白的表达增加。11.冰冻切片显示绿色荧光蛋白密集分布于细胞内。根据Western blot、Real-time PCR结果,敲减效率接近50%。12.肉眼观察D-Gal N/LPS联合给药后12h肝脏呈紫红色,充血肿胀,弥漫出血点。光镜下观察肝细胞条索断裂,小叶结构不清,肝血窦扩张,肝细胞核溶解碎裂,见大量核碎屑,肝细胞核固缩,kuffer细胞增生。光镜、电镜下观察肾小球、近曲小管、远曲小管结构均正常。13.D-Gal N/LPS组及LV-sh RNA-NC组ALT、AST、BUN、Cr、TNF-α、ET-1均在给药后12h明显升高,与对照组相比有显著性差异(P0.05)。LV-sh RNA-PKC-α组的Cr、BUN水平与D-Gal N/LPS组及LV-sh RNA-NC组比较均明显降低,有显著性差异(P0.05),但ALT较两组相比无显著性差异(P0.05)。K~+、Na~+、Cl~-浓度无明显变化。14.D-Gal N/LPS组、LV-sh RNA-NC组对比NS组12小时GFR显著降低,有显著性差异(P0.05)。D-Gal N/LPS组、LV-sh RNA-NC组相比12小时GFR没有显著差异(P0.05)。LV-sh RNA-PKC-α组12小时GFR与D-Gal N/LPS组及LV-sh RNA-NC组相比较明显增加,有显著性差异(P0.05),与NS对照组比较,校正后的GFR(GFR2,GFR3)比校正前(GFR1)更接近正常水平。15.D-Gal N/LPS组及LV-sh RNA-NC组12小时IP_3R1蛋白呈高水平表达,两者之间无显著性差异(P0.05);而LV-sh RNA-PKC-α组IP_3R1蛋白表达明显减少,与D-Gal N/LPS组及LV-sh RNA-NC组比具有显著性(P0.05)。16.D-Gal N/LPS组及LV-sh RNA-NC组12小时肾小球内Ca~(2+)离子浓度在ET-1刺激后对比基线值比值明显升高,两者之间无显著性差异(P0.05);而LV-sh RNA-PKC-α组ET-1刺激后Ca~(2+)离子浓度与基线比值与D-Gal N/LPS组及LV-sh RNA-NC组相比显著降低,具有显著性(P0.05)。17.D-Gal N/LPS组及LV-sh RNA-NC组12小时肾小球容积明显降低,两者之间无显著性差异(P0.05);而LV-sh RNA-PKC-α组肾小球容积明显改善,与D-Gal N/LPS组及LV-sh RNA-NC组比具有显著性(P0.05)。18.各组间大鼠尿液总蛋白、尿微量白蛋白(MAU/ALB)及N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)结果无显著性差异(P0.05)。结论:1.TNF-α可诱导GMCs中IP_3R1表达的显著上调,且IP_3R1 mRNA的转录先于IP_3R1蛋白的翻译,该结果说明TNF-α可在基因转录水平上调控IP_3R1的表达。2.TNF-α处理的GMCs中,PKC-α蛋白及mRNA的表达明显增强,并与TNF-α上调IP_3R1蛋白表达密切相关。3.敲减PKC-α可以明显抑制GMCs细胞内由TNF-α诱导的IP_3R1蛋白及mRNA的表达。4.敲减PKC-α可以明显抑制GMCs细胞内由TNF-α诱导细胞内Ca~(2+)释放增加。5.TNF-α处理GMCs后,SP-1蛋白的表达明显增强,且与IP_3R1promoter的结合明显增强。6.敲减PKC-α可以明显抑制GMCs细胞内由TNF-α诱导的SP-1蛋白的表达及与IP_3R1 promoter的结合。7.TNF-α处理GMCs后JNK/p-JNK蛋白的表达明显增强,而敲减PKC-α可以明显抑制TNF-α诱导的JNK/p-JNK蛋白的表达增强。8.应用JNK抑制剂可以明显抑制TNF-α诱导的SP-1蛋白及IP_3R1mRNA及蛋白的表达。9.D-Gal N/LPS预处理SD大鼠12h后肝细胞严重坏死,Cr显著升高,GFR显著下降。在动物水平模拟了人暴发性肝衰竭发生急性肾损伤的部分病理生理过程。10.预先注入靶向PKC-α基因的重组慢病毒载体可以明显改善大鼠肾功,并部分改善大鼠GFR。11.预先注入靶向PKC-α基因的重组慢病毒载体可以明显抑制肝坏死大鼠肾脏IP_3R1蛋白及mRNA的表达。12.预先注入靶向PKC-α基因的重组慢病毒载体可以明显降低ET-1刺激后Ca~(2+)离子浓度与基线比值。13.预先注入靶向PKC-α基因的重组慢病毒载体可以明显改善肾小球容积。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575.3
【图文】：

序列,效率,蛋白,内参

10 1，siRNA-PKC-α 敲减 mRNA 效率检测（n=3）。A，敲减 24 小时 PKC-α mRNA 表达况。B，敲减 48 小时 PKC-α mRNA 表达情况。（* P<0.05 vs siRNA-NC）.2 Western Blot 分析 siRNA 敲减效率各组 80KD 处均可见特异性 PKC-α 蛋白条带，42KD 处内参 β-actin 蛋白。瞬转后 24h 及 48h 不同浓度不同条组带敲减效率分别为（图 2A，B），选减效率超过 50%以下序列。根据结果，综合选择 NM_001105713.1_siRNA_4带继续下一步实验。

效率,蛋白表达,处理组,情况

11图 2，siRNA-PKC-α 敲减蛋白效率检测（n=3）。A，敲减 24 小时 PKC-α 蛋白表达情况。B，敲减 48 小时 PKC-α 蛋白表达情况。（* P<0.05 vs siRNA-NC）3.3 Real Time PCR 分析 IP3R1、PKC-α mRNA 表达情况TNF-α 处理组与对照组（1.00±0.15）相比 IP3R1 mRNA 的表达明显增加，2h开始升高（1.18±0.52，P=0.455）, 4h 继续上升（1.48±0.80，P=0.059），以 8h 最为明显（2.22±0.53，P=0.000），24h mRNA（1.04±0.08，P=0.88）表达回落接近

【参考文献】