玉米抗冷基因ZmGDH2的功能分析及遗传转化的研究

发布时间：2020-06-26 16:55

【摘要】：玉米是全世界最重要的作物之一。东北地区作为我国玉米的主要产区,由于地理位置和气候因素的影响,玉米生产经常遭受冷害,导致玉米相关生理机能受损,代谢抑制,引起氧化、高渗及发育缓慢,严重影响玉米产量。因此通过遗传改良等方法提高玉米的冷胁迫适应能力就显得尤为重要。针对以上问题,本研究对玉米耐冷相关基因ZmGDH2(玉米谷氨酸脱氢酶基因)进行了克隆、功能验证及遗传转化。研究结果如下:1.通过RT-PCR技术,从抗冷玉米自交系W9816中成功克隆到1236bp的ZmGDH2编码序列,其编码含411个氨基酸的功能蛋白。染色体定位分析发现ZmGDH2位于10号染色体,基因全长4453bp,包含9个外显子。以海栖热袍菌GDH(PDB:1B3B)为蛋白模板,构建了玉米GDH2蛋白三维结构,发现玉米GDH2具备相对较高的柔性和较差的热稳定性,适于在低温环境下发挥作用。利用DNAMAN对多种植物的谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列进行比对,发现GDH2蛋白具有较强的保守性,玉米GDH2与高粱等作物GDH2相似性高达88%以上。2.以抗冷玉米自交系W9816为实验材料,利用qRT-PCR方法,分别测定其在4℃处理0h、6h、12h、24h和48h后,ZmGDH2基因在根、茎、叶等组织中的表达量。结果发现,在不同组织中,ZmGDH2基因对不同处理时长的冷胁迫响应存在显著的差别,其中在叶中响应最为明显。3.构建了ZmGDH2基因的过表达载体pCHF3300-35S-ZmGDH2,并获得了过表达ZmGDH2基因的转基因拟南芥材料。以野生型拟南芥和纯合突变体为参照,对转基因拟南芥进行耐冷表型鉴定及丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量和过氧化物歧化酶(POD)活性等相关生理指标的测定,结果发现过表达ZmGDH2基因提高了拟南芥植株对冷胁迫的耐受力。4.利用农杆菌介导法对玉米骨干自交系Y423的幼胚和愈伤进行了ZmGDH2基因的遗传转化。侵染幼胚共获再生植株607株,PCR检测为阳性的转化植株29株,阳性转化率为4.78%;侵染愈伤共获再生植株944株,PCR检测为阳性的转化植株34株,阳性转化率为3.6%。对T0代转化植株进行qRT-PCR分析,发现ZmGDH2基因在阳性转化植株中的表达量显著高于对照。5.对农杆菌介导的玉米遗传转化体系进行了优化,结果发现在转化所用培养基(共培养培养基和重悬液)内每升加入10g葡萄糖,转化效率可以从4.32%提高到5.06%;侵染前对受体材料进行3min 45℃热激处理,幼胚转化率从3.70%提高到6.25%,愈伤转化率从2.85%提高到3.93%。6.利用花粉管通道法对玉米骨干自交系10Z27进行ZmGDH2基因遗传转化,获得T0代玉米12穗,共计6956粒。T0代植株经喷施0.15%Basta溶液筛选和PCR鉴定,共获得阳性植株76株,转化率为1.1%。对T0代植株进行自交授粉,现已收获T1代种子2798粒。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2;S513

【参考文献】