武昌罗索线虫性别分化差异基因筛选及功能研究

发布时间：2020-06-26 18:08

【摘要】：昆虫病原索科线虫是一类非常宝贵的昆虫天敌资源,在蔬菜、农林及卫生害虫生物防治方面具有很好的应用前景。该类线虫的性别分化较为特殊,寄生期的营养竞争压力决定其雌、雄性别分化(属环境决定型),然而目前有关动物这一特殊性别分化的分子机理研究的较少。本课题组前期利用秀丽线虫(Caenorhabdiris elegans)相关研究背景,对蚊类病原武昌罗索线虫(Romanomermis wuchangennsis)的寄生后期幼虫(J4)和成虫进行了转录组测序分析并筛选到部分相关性别分化基因,但并未对性别分化关键的寄生期幼虫(J3)进行转录组测序分析,其相关性别分化基因的功能也缺乏更深入的研究。因此,进一步探讨影响武昌罗索线虫性别分化基因及其功能具有重要的理论和现实意义。本研究首先观察了武昌罗索线虫寄生期幼虫(J3)在宿主致倦库蚊孑孓体内寄生的系列形态变化,探明了线虫与宿主感染比例及寄生后期幼虫脱出时间等因素对该线虫雌、雄性别分化或比例的影响。然后取材雌、雄武昌罗索线虫不同寄生期幼虫(J3)样本进行转录组测序。最后依据秀丽线虫性别决定通路,筛选性别相关基因,采用荧光定量PCR、RNA干扰及原位杂交等技术对部分基因进行功能研究,探究基因在线虫不同发育期的表达量及干扰后对其性别分化的影响。其结果如下。1.寄生期幼虫形态及生物学观察为了解武昌罗索线虫寄生期幼虫及其宿主的形态变化,本研究利用体视显微镜对感染后的孑孓进行观察,发现从线虫寄生的第5天开始,孑孓体内胸部缠绕有寄生期幼虫;解剖孑孓发现:线虫在寄生3天后其体长成倍增长,第5天的寄生期幼虫体内滋养物体开始大量堆积。线虫完成寄生期的生长发育后从宿主体内脱出并导致孑孓死亡,脱出的寄生后期幼虫外形已出现明显的性别特征,能明显观察到雌性个体较雄性的大,在体视显微镜下能清楚看到雌性个体身体中前部的阴道口。对线虫寄生时间和感染比例进行研究结果表明:在26 ℃培养条件下,最早在寄生第6天脱出的线虫均为个体较小的雄性寄生后期幼虫,寄生第8天后脱出的均为体型较大的雌性寄生后期幼虫。感染比例(线虫:孑孓)为1:1时脱出的线虫全为雌虫,感染比例为40:1时脱出的线虫全部发育为雄虫。即:宿主体内寄生的线虫越多,每条线虫所能获得的营养越少,越有可能发育为雄虫;相反则发育成雌虫。2.寄生期幼虫的转录组测序通过对所选用寄生3d、4d、5d雌雄幼虫分别进行转录组测序并结合本课题组前期转录组数据分析结果,同时参照模式线虫的性别决定通路筛选出fox-1、tra-2、laf1、tra-3、fem-1、tra-1、mab-3、mab-7、mab-5、gld-1、egl-4 等 11 个与性别分化相关的基因。课题组前期已对laf-1、mab-3、tra-2等基因进行了初步研究,在此基础上,本研究选取以下4个基因fem-1、fox-1、mab-7、tra-1进行更进一步的功能分析。3.武昌罗索线虫性别分化候选基因的功能研究(1)Rwufem-1、Rwufox-1、Rwumab-7和Rwutra-1 基因序列分析利用生物信息学构建N-J进化树进行序列多重比对,结果显示Rwufem-1、Rwufox-1、Rwumab-7和Rwutra-1 个基因均与中华卵索线虫(Ovomermis sinensis)的聚为同一枝,亲缘关系最近。(2)Rwufem-1、Rwufox-1、Rwumab-7和Rwumab-1的荧光定量 PCR荧光定量结果显示:①Rwufem-1基因在3天寄生期幼虫及雌、雄成虫相对表达量出现极显著差异(p0.01),7天寄生后期雌、雄幼虫间相对表达量出现显著差异(p0.05);②Rwufox-1基因在3天寄生期幼虫、1天寄生后期雌雄幼虫相对表达量出现显著差异(p0.05);③Rwumab-7基因在3天、5天寄生期幼虫,1天寄生后期雌雄幼虫相对表达量出现极显著差异(p0.01),5、7天寄生后期幼虫相对表达量出现显著差异(p0.05);④Rwutra-1基因在3天寄生期雌、雄幼虫及成虫相对表达量出现极显著差异(p0.01),在5天寄生后期幼虫基因表达量出现显著差异(p0.05)。(3)Rwufem-1、Rwufox-1、Rwumab-7 和 Rwutra-1 的 RNAi 实验RNAi结果显示:①干扰Rwufem-1基因后,脱出线虫的雌、雄性比与对照组相比明显增加且差异极显著(P0.01),表明Rwufem-1基因被干扰后幼线虫朝向雌性化发育;②Rwufox-1基因干扰后,线虫雌、雄性比减小且差异极显著(p0.01),表明Rwufox-1基因被干扰后幼线虫偏向雄性化发育;③Rwumab-7基因干扰后实验组与对照组相比没有差异(p0.05),推测可能与dsRNA长度和位置不合适等因素有关;④干扰Rwutra-1基因后脱出线虫的雌、雄性比与对照组相比明显增加且差异极显著(p0.01),表明Rwutra-1基因被干扰后线虫朝向雌性化发育。(4)Rwufem-1、Rwufox-1、Rwumab-7和Rwutra-1的原位杂交实验原位杂交实验结果显示:①Rwufem-1原位杂交结果显示该基因在雌性成虫中少量表达,杂交信号较弱;在雄性成虫中大量表达,且越靠近线虫尾部杂交信号越强,该基因可能对雄性精子发育起重要作用,推测武昌罗索线虫在寄生第3天时启动雄性性别分化。②Rwufox-1原位杂交结果显示:该基因在雌性成虫中大量表达,杂交信号较强;在雄性成虫中少量表达,杂交信号较弱;推测Rwufox-1基因与武昌罗索线虫雌性配子的发育有关。③Rwumab-7原位杂交结果显示该基因在雌性成虫中少量表达,杂交信号较弱;在雄性成虫中大量表达,杂交信号较强;推测Rwumab-7参与雄性的发育、雄配子的形成以及雄性性腺的发育过程。④Rwutra-I原位杂交结果显示该基因在雌性成虫中少量表达,杂交信号较弱;在雄性成虫中大量表达,杂交信号较强;推测Rwutra-1可能与武昌罗索线虫雄性线虫的生殖腺发育有关。综上实验结果与分析,本研究对线虫和宿主进行了形态观察,验证了武昌罗索线虫性别决定发生于寄生期,另外线虫寄生时间的长短和感染比例高低的实验验证了该线虫的性别分化与其寄生期所获营养的多少有关。在此基础上,通过荧光定量、RNA干扰、原位杂交等实验方法初步探明了上述4个基因:推测Rwufem-1、Rwumab-7和Rwutra-1可能参与雄性武昌罗索线虫的发育;Rwufox-1基因与雌性线虫的发育有关。本研究结果为后续索科线虫性别分化与性别决定通路的研究提供了素材和科学数据。
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476.15
【图文】：

３．１武昌罗索线虫寄生在孑孓体内的形态变化逡逑将寄生线虫的孑孓放置冰上冷冻３０邋ｍｉｎ，置于载玻片上用解剖针挑破孑孓体逡逑壁，挑出线虫，在寄生第３天时解剖出的线虫体型特别小（图３．１邋Ａ），随着寄生逡逑时间的增加，线虫在孑孓体内迅速生长，直至完成寄生生活从孑孓体内脱出（图３．１逡逑Ｆ）邋0逡逑］逡逑ＡＢＣ逡逑Ｄ逦Ｅ逦Ｆ逡逑图３．１武昌罗索线虫寄生在孑孓体内的形态逡逑Ｆｉｇ．邋３．１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｐａｒａｓｉｔｉｃ邋ｊｕｖｅｎｉｌｅｓ逡逑Ａ：第３天寄生期线虫；Ｂ：第４天寄生期线虫；Ｃ：第５天寄生期

３．１武昌罗索线虫寄生在孑孓体内的形态变化逡逑将寄生线虫的孑孓放置冰上冷冻３０邋ｍｉｎ，置于载玻片上用解剖针挑破孑孓体逡逑壁，挑出线虫，在寄生第３天时解剖出的线虫体型特别小（图３．１邋Ａ），随着寄生逡逑时间的增加，线虫在孑孓体内迅速生长，直至完成寄生生活从孑孓体内脱出（图３．１逡逑Ｆ）邋0逡逑］逡逑ＡＢＣ逡逑Ｄ逦Ｅ逦Ｆ逡逑图３．１武昌罗索线虫寄生在孑孓体内的形态逡逑Ｆｉｇ．邋３．１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｐａｒａｓｉｔｉｃ邋ｊｕｖｅｎｉｌｅｓ逡逑Ａ：第３天寄生期线虫；Ｂ：第４天寄生期线虫；Ｃ：第５天寄生期

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本文编号：2730699