鸽PPARγ基因的克

发布时间：2020-06-26 19:13

【摘要】：过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)是一种由配体激活的核转录因子,在脂类代谢调控中发挥重要作用。本研究旨在克隆鸽(Columba livia)PPARγ基因的全长cDNA序列,并分析该基因编码的蛋白质理化性质和结构特征,揭示其组织表达特征。以鸽脾脏组织总RNA为模板,采用快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA ends,RACE)方法,克隆到PPARγ基因的cDNA序列,并运用生物信息学的方法对其进行分析,运用实时荧光定量PCR检测PPARγ基因在鸽心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肌肉组织中的表达情况。研究结果表明,鸽PPARγ基因(Gen Bank No.KU166859.2)cDNA全长1 846 bp,包含1 428 bp的开放阅读框,63 bp的5'端非编码区和355 bp的3'端非编码区,共编码475个氨基酸。经预测,鸽PPARγ基因编码的蛋白质由7 661个原子组成,分子式为C2436H3840N644O714S27,等电点为6.19,相对分子质量为54.438 79 k D,平均亲水性为-0.287。结构预测表明,鸽PPARγ蛋白具有2个锌指结构以及配体结合域。鸽PPARγ氨基酸序列与杜鹃(Cuculus canorus)、鸭(Anas platyrhynchos)、鹦鹉(Melopsittacus undulates)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata)、火鸡(Meleagris gallopavo)、鸡(Gallus gallus)、鹌鹑(Coturnix japonica)、猪(Sus scrofa)、人(Homo sapien)、小鼠(Mus musculus)和斑马鱼(Danio rerio)的同源性分别为97%、97%、96%、96%、96%、96%、96%、92%、91%、90%和64%。构建的系统发生树显示,鸟类和哺乳动物各形成一个大的分支,斑马鱼形成一个独立分支,与鸽的聚类顺序较近的物种为杜鹃和鸭,该结果与这些物种在生物学上的分类是基本一致的。荧光定量PCR结果显示,PPARγ基因在肺组织中的表达量最高,较高表达于肾脏、肝脏、脾脏和心脏,而在肌肉组织中的表达量最低。本研究获得了鸽PPARγ基因的cDNA序列、分子的结构特点及组织表达特征,提示可能与其在不同组织中的功能有关,该结果为进一步研究PPARγ结构和功能提供了理论依据。
【图文】：

电泳分析,序列,氨基酸残基,亲水性

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology所得的序列设计并合成5'RACE和3'RACE特异性引物，以脾脏总RNA为模板，采用GeneRacerTMKit试剂盒分别合成5'RACE和3'RACE模板，然后参照试剂盒说明书进行5'RACE和3'RACEPCR反应，电泳检测分别得到大小约400bp(图1B)和480bp(图1C)的特异性条带，PCR扩增产物经回收克隆测序获得的长度分别为335和484bp。通过对上述获得的片段进行拼接，获得鸽PPARγ基因的全长cDNA序列，共计1846bp，包括5'端非编码区(5'UTR)为63bp，3'端非编码区(3'UTR)为355bp，编码区(CDS)序列长度为1428bp，编码475个氨基酸。序列已提交GenBank登录号：KU166859.2(图2)。2.2鸽PPARγ蛋白特征的生物信息学分析通过ExPASy蛋白质组服务器中的ProtParam工具分析鸽PPARγ预测蛋白的生理生化特性，其等电点为6.19，分子量为54438.79，由7661个原子组成，分子式为C2436H3840N644O714S27，负电荷氨基酸残基总数为65(Asp+Glu)，正电荷氨基酸残基总数为59(Arg+Lys)，蛋白不稳定指数为52.33，脂肪系数为89.12。通过ProtScale工具分析其亲疏水性，结果发现，最小值为-2.744，位于第157个氨基酸残基，具有高亲水性，最大值为3.600，位于第386和387个氨基酸残基，具有较强的疏水性。进一步分析发现，在27~30、58~62、91~101、151~163、183~188、239~241、259~261、267~274、422~426和458~460等区域具有较高的亲水性(Score＜-1)，而在324~328和383~391等区域具有明显的疏水性(Score＞1)(图3)，平均亲水性为-0.287。应用SMART在线程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)对鸽PPARγ蛋白质结构域进行预测，结果显示，鸽PPARγ具有2个C4-锌指结构模块参与的核激素受体DNA?

亲水性,蛋白,免疫调节,组织表达

hietal.,2008)。此外，PPARγ在免疫调节方面发挥重要作用(Bensinger,Tontonoz,2008)。由于组织表达分布与其功能是密切相关的，PPARγ基因的表达主要分布在脂肪代谢和免疫调节活跃的组织中，因而与本研究结果一致。其他禽类动物中有关PPARγ基因的组织表达情况也进行了报道，但结果存在一定的差异，可能是由于物种、日龄和营养水平等差异引起的。研究发现，PPARγ基因在30周龄鸡脂肪组织中表达量为所有检测组织中最低，这与哺乳动物的研究结果截然相反，另外，PPARγmRNA在肝脏、骨骼肌和卵巢组织中的表达水平随图3鸽PPARγ蛋白亲水性/疏水性分析Figure3Thehydrophilicity/hydrophobicityanalysisofpigeonPPARγprotein-3-2-10123450100150200250300350400450位置Position分评coreS图4鸽PPARγ蛋白质保守结构域分析Figure4TheconservedproteindomainanalysisofpigeonPPARγZnF_C4：C4锌指；HOLI：激素受体的配体结合域；鸽PPARγ蛋白具有明显的ZnF_C4结构域和HOLI结构域ZnF_C4:C4zincfinger;HOLI:Ligandbindingdomainofhormonereceptors;TheproteinofpigeonPPARγwaspredict-edtodistinctlyhaveZnF_C4andHOLIdomain0100200300400634

【参考文献】