构巢曲霉几丁质酶ChiB基因克隆表达、酶学特性及生理功能研究

发布时间：2020-06-27 22:19

【摘要】：真菌细胞壁是位于真菌原生质体外的一种动态的刚性结构,对维持细胞壁的形态和细胞正常的生理活动起非常重要的作用。在真菌细胞生长发育过程中,细胞壁结构和组成发生改变,主要表现为细胞壁扩张。对酵母和曲霉细胞壁的研究发现,细胞壁的扩张是在一系列酶的参与下完成的,几丁质酶是其中较为重要的酶类。我们实验室前期研究发现几丁质酶可以促进灰盖鬼伞顶端菌柄细胞壁的伸长生长。几丁质酶促进细胞壁伸长生长这种理论是否适用于曲霉菌丝细胞壁的伸长生长呢?所以本论文研究了几丁质酶ChiB相关的酶学特性及该酶在菌丝细胞壁伸长生长中的功能。为研究构巢曲霉几丁质酶在曲霉菌丝伸长生长中的功能,我们以构巢曲霉为研究材料,初步分析了其基因组中几丁质酶基因,并筛选了其中较为重要的基因进行重组表达研究,最终获得了1个具有相应活性的几丁质酶,并对该酶的酶学性质及其生理功能进行了研究。以原核表达系统中的大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主细胞,成功表达出了几丁质酶(ChiB)蛋白。几丁质酶片段经大肠杆菌密码子偏好性分析以后,对片段进行优化合成,连接到pET28A上形成重组质粒,转到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中形成重组菌株。重组菌在18℃下经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养24h后表达出大量的目的蛋白,菌体经超声破碎以后获得破碎上清,上清经Ni-柱层析后纯化得到ChiB蛋白,ChiB蛋白分子量大小为45kDa。酶学性质测定结果表明:1)该酶最适反应温度为50℃,最适反应pH环境为pH6.0;2)最适底物为胶态几丁质。以乙二醇几丁质为底物时反应动力学参数为Km=1.99mg/mL,Vmax=0.155μmol·mg-1·min-1;3)ChiB,18家族的几丁质酶,以水解保留机制对底物进行水解。该几丁质酶分别作用于(GlcNAc)2-6寡糖和几丁质粉末和胶态几丁质底物,底物和水解产物产物经HPAEC-PAD分析,研究结果表明该酶是外切几丁质酶具有微弱的内切活性,并且具有转糖基活性。我们实验室前期研究已说明能够水解几丁质粉末的几丁质酶可以促进菌柄伸长,本论文的研究结果进一步证明了这一结论。在体外,该几丁质酶作用于热灭活的灰盖鬼伞菌柄伸长区域,结果表明该几丁质酶可以重构热灭活的灰盖鬼伞菌柄的伸长。进一步希望在构巢曲霉体内通过荧光定位的方法确定该几丁质酶在菌丝生长发育过程中在细胞内的定位,但是在本论文中没有观察到该几丁质酶蛋白在细胞中的定位,可能是由于该几丁质酶在菌丝发育中表达量低。尽管如此,通过几丁质酶对热灭活的灰盖鬼伞菌柄伸长区域的测定实验,我们推测该几丁质酶可能参与菌丝细胞壁的扩张,通过打破细胞壁中原有的糖链结构,并在转糖昔酶的作用下形成复杂的网状结构。研究细胞壁相关的水解酶有利于我们更好的理解在真菌生长发育过程和形态发生过程这些水解酶的功能,同时为利用这些特定的几丁质酶来水解外源几丁质和研发抗真菌药物和农业上的杀真菌剂提供理论支持。研究这个课题,对于控制医学和农业上病源真菌的增殖或促进工业和农业上生产真菌的生长具有非常重要的科学和实践意义。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q936;Q78
【图文】：

几丁质,乙酰,化学结构,方框

图１．１邋ａ：几丁质的化学结构（灰色的方框结构代表一个Ｎ－乙酰葡聚糖胺单体）ｂ：两种类型的丁质链：ａ－几丁质和卩－几丁质逡逑Ｆｉｇ．邋１．１逦（ａ）邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｃｈｉｔｉｎ．邋Ｔｈｅ邋ｇｒｅｙ邋ｂｏｘ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｏｎｅ邋Ｎ－ａｃｅｔｌｙｇｌ｜ｉｃｏｓａｍｉｎｅ邋ｓｊｉｂｆｍｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｈｉｔｉｎ邋ｃｈａｉｎ，邋（ｂ）邋Ｔｈｅ邋ｔｗｏ邋ｍａｊｏｒ邋ｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋ｃｈｉｔｉｎ邋ａｒｅ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ邋ｂｙ邋ａｎ邋ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ邋（ａ－ｃｈｉｔｉｎ）邋ｏｒ逡逑ｐａｒａｌｌｅｌ邋（ｐ－ｃｈｉｔｉｎ）邋ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｈａｉｎｓ．逡逑

真菌细胞壁,几丁质

第一章绪论白逡逑白：在真菌细胞壁的中含有大量的Ｎ－连接和０－连接的糖蛋白，在许多壁蛋白通过糖基磷脂酰肌醇锚（ＧＰＩ）粘附在细胞壁或细胞膜上。细胞菌菌丝的生长发育和真菌形态的形成。在菌丝正常的生长发育过程中，护几丁质免受几丁质水解酶的水解作用，Ｊ：说ｒｏｖ／ｒ／办孢子萌发时该酶响几丁质水解对细胞壁的水解作用。逡逑细胞壁的结构逡逑细胞壁主要由糖蛋白、葡聚糖和几丁质组成。几丁质主要位于细胞膜的穿于整个细胞壁，糖蛋白被Ｎ－连接和０－连接的低聚糖修饰，通过ＧＰＩ到细胞膜上。糖蛋白，葡聚糖和几丁质相互交联形成复杂的网状结构，结构基础如图１．２〃５］。逡逑

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