几种植原体病害病原分子鉴定与枣疯植原体imp基因克隆

发布时间：2020-06-27 23:26

【摘要】：植原体是一类引起植物病害的重要原核致病菌,在植物韧皮部的筛管中专性寄生。植原体危害严重,在世界范围内,受到植原体危害的植物有近千种,对经济作物、粮食作物以及观赏型作物,均造成了巨大的损失。由于植原体传播范围广,加强植原体的检测与鉴定就成为了防治该病害的基础。本实验主要以植原体病原为研究对象,对几种植原体病害进行调查与病原鉴定,并对枣疯植原体imp基因克隆。主要实验结果如下:1.通过对20株具有丛枝、黄化及叶片病变的植物进行调查和取样,经过16S rRNA基因的PCR扩增和测序鉴定,发现桑树丛枝(mulberry witches'broom,MWB)、槐树丛枝(Robinia pseudoacacia witches'broom,RpWB)、丝绵木丛枝(Euonymus bungeanus witches'broom,EbWB)、杏树卷叶(apricot leafroll)、红花槐丛枝(Robinia pseudoacacia cv.Honghuahuai witches'broom,RpWB-HHH和一品红丛枝(poinsettia branch-inducing,PoiB)样品均携带植原体,推断为植原体病害。2.利用16S rRNA基因及转运通道蛋白基因secY、延伸因子基因tuf和核糖体蛋白基因rp序列引物扩增桑树丛枝病原,将其测序序列进行核苷酸同源性分析比对。结果发现桑树丛枝与翠菊黄化组的16SrⅠ-B亚组典型成员的相似率为99.12%;与rpⅠ-B亚组、tufⅠ-B亚组和secYⅠ-B亚组桑树萎缩的相似性分别达到99.59%、99.08%和99.48%。通过构建系统进化树和模拟RFLP分析发现桑树丛枝属于与16SrⅠ-B亚组、rpⅠ-B亚组、tufⅠ-B亚组和secYⅠ-B亚组的成员。3.使用16S rRNA、secY、rp、himA、tmkB和imp基因序列引物对枣疯病、槐树丛枝、丝绵木丛枝和红花槐丛枝4个植原体病害样品DNA进行PCR扩增,并进行测序和序列比对分析,构建其系统进化树。结果表明这4种植物的植原体16S rRNA基因序列都与16SrⅤ-B亚组处于同一分支;rp基因序列都与rpⅤ-C亚组成员接近;secY基因都与secYⅤ-C亚组接近;在himA和imp基因序列比对中,4种植原体都具有较高的相似率(大于95%),但是丝棉木丛枝植原体的tmkB基因序列与其他三株植原体相比,出现了较大差异,相似率均在74%左右。4.对枣疯植原体免疫膜蛋白基因imp进行了PCR扩增和克隆,对Imp蛋白的跨膜区进行了预测,构建了蛋白表达载体异源表达Imp蛋白,结果发现Imp具有一个跨膜区,完整的imp基因无法得到异源表达蛋白,去掉跨膜区后Imp蛋白得到表达。
【学位授予单位】：北京农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.4
【图文】：

采集样品,凝胶电泳,PCR扩增,相似率

图 2-2 采集样品的 16S rDNA 保守序列 PCR 扩增凝胶电泳图注：M：markerr；ck：已知枣疯植原体基因对照；1～30：对应表 2-1 样品顺序.3.3 基因比对分析将上述 PCR 产物送测序公司测序，所得序列用 BLAST 软件进行序列比对分析，结果表明树丛枝植原体的 16S rDNA 序列和 GenBank 中登录的 MD（登录号：KP662132）比对后发现苷酸同源序列相似率达到了 99.52%；槐树丛枝植原体的 16S rDNA 序列和 RpWB（登录号F848965）比对后核苷酸同源序列相似率为 99.93%；丝绵木丛枝植原体的 16S rDNA 序列与号为 KX669030 的 EbWB 进行核苷酸同源序列相似率比对，其相似率达到 99.93%；而对照病的16S rDNA序列与枣疯JWB菌株（登录号：AB442218）核苷酸同源序列相似率达到了100花槐丛枝的 16S rDNA 序列和 GenBank 中登录的洋刺槐丛枝（登录号：MF848965）比对后，核苷酸同源序列相似率为 98.76%；一品红样品与 PoiB（登录号：HQ589205）进行核苷酸序列相似性比对，其相似率达到 97.91%（表 2-2）。表 2-2 16S rDNA 基因的核苷酸序列比对样品对比植原体病害相似率/% 登录号桑树丛枝（MWB）桑树萎缩病（MD） 99.52% KP662132

丛枝,桑树,植原体,相似系数

农学院硕士学位论文第 3 章桑树丛枝（MWB）病原物的分eighbor-Joining）构建系统进化树。再将 4 种基因用 pDRAW32 软件进行模拟 RELP 分析似系数 F，相似系数计算公式：F=2×Nxy/(Nx+Ny) , F 代表相似系数，Nx和 Ny分别表示被个样品（X 和 Y）的酶切条带数，Nxy表示两个样品酶切后相同位置的 DNA 片段数[223 PCR 结果与序列比对分析.1 PCR 扩增结果以桑树丛枝样品总 DNA 为 PCR 扩增的模板，PCR 扩增桑丛枝病植原体 rp、tuf、secY 和A 基因，分别得到大小约为 1.2kb、0.8kb、1.4kb 和 1.4kb 的目的片段（图 3-1）。

【参考文献】