桑树Kunitz基因的表达分析及MnKPI-9在家蚕消化道中的稳定性

发布时间：2020-06-29 07:15

【摘要】：Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类特异的抑制蛋白酶活性的分子。作为效应分子,直接作用于病原微生物和植食性昆虫。桑树(Morus alba L)具有众多优良的性状,是重要的经济林木。在自然界中,桑树面临着病原微生物、农业害虫等的威胁。家蚕(Bombyx mori)属于鳞翅目昆虫,寡食桑叶。家蚕与桑树“吃”与“被吃”的关系是一个协同进化的过程。植物Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂作为一种防御手段,主要在植食性昆虫的消化道中起作用,因此鉴定桑树Kunitz基因,研究家蚕咬食处理下表达模式及MnKPI-9蛋白在家蚕的消化道中是否具有活性,了解桑树Kunitz蛋白是否参与防御家蚕的咬食,为解析桑树及其寡食性昆虫的相互作用提供线索。研究的内容及结果如下:1.桑树Kunitz基因的鉴定、克隆及生物信息学分析本研究利用生物信息学的方法,在川桑(Morus notabilis)基因组中共鉴定得到20个Kunitz基因,分别命名为MnKPI-1-20(Kunitz-type serine proteinase inhibitors,KPIs)。克隆得到上述20个Kunitz基因。除MnKPI-6和MnKPI-20之外,其它Kunitz基因在N端具有信号肽,且20个Kunitz基因均具有保守的Kunitz结构域,克隆得到的20个Kunitz基因同源性较高。基因结构分析表明16个桑树Kunitz基因无内含子。通过NJ法构建系统发生树,发现聚为一类的桑树Kunitz基因位于同一个scaffold上,呈现基因串联排布的现象。将包括桑树在内的132个Kunitz基因构建系统发生树分析表明,桑树分布于C类群的I3B家族的Kunitz基因与野草莓、苹果和桃的Kunitz基因具有较高的序列同源性,且与蒺藜苜蓿和大豆的亲缘关系比较近。通过分析桑树Kunitz基因上游转录调控位点,发现主要包括光响应元件、激素响应元件和胁迫响应元件三类。2.桑树Kunitz基因表达分析利用qRT-PCR技术检测桑树Kunitz基因在川桑根、茎、叶、雌花和雄花5个组织的表达水平。结果表明,6个Kunitz基因在花中表达量相对较高,而MnKPI-6、MnKPI-7主要在根中表达。利用qRT-PCR技术检测家蚕咬食处理下桑树Kunitz基因在川桑叶片中的转录水平。结果表明,桑树9个Kunitz基因在家蚕咬食处理后表达量不同程度地上调,响应家蚕咬食的诱导。3.MnKPI-9蛋白水平的表达分析及在家蚕消化道中的稳定性分析通过Western Blot技术检测MnKPI-9蛋白的组织表达水平及家蚕咬食处理后的表达水平。结果表明,正常状态下MnKPI-9蛋白主要在川桑的雄花中表达;响应家蚕咬食的诱导。与转录本水平的表达相比,蛋白水平组织表达模式基本一致,蛋白质诱导表达的时间有所延迟。通过比较MnKPI-9蛋白在川桑叶片、喂食川桑叶片的家蚕中肠内容物和粪便中的含量分析发现,MnKPI-9蛋白在家蚕的消化道中完整而稳定地存在。结合Native-PAGE技术进一步证明MnKPI-9蛋白在家蚕消化道中具有活性。对后续研究MnKPI-9蛋白防御昆虫咬食桑树的功能提供一个重要的线索。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S888.2
【图文】：

植食性昆虫,植物

西南大学硕士学位论文除了直接防御外，植物还可以利用其它机制来保护自己。植食性昆虫有大量的天敌，如食肉动物和寄生蜂，植物通过加强这些天敌的效应，将其作为保护自身的保镖，这种防御方式被称为间接防御。这种类型的防御包括提供避难所、食物和化学信号，例如，植物可以为蚂蚁和具有掠夺性的螨虫提供巢穴，在植物受到害虫攻击时保护其免受伤害；植物也提供肉食动物所需的食物如蜂蜜或者被害虫咬食时释放的挥发物，玉米（Zea mays）在斜纹夜蛾（Prodenia litura）咬食时，释放莽草酸的挥发物从而吸引它的天敌绒茧蜂（Cotesiamarginiventris）来对付斜纹夜蛾[22]；番茄（Lycopersicon esculentum）在甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）咬食时，会吸引它的天敌寄生蜂（Hyposoter exiguae）来对付甜菜夜蛾，从而保护番茄免受甜菜夜蛾的咬食（图 1.1）[23]。

信号转导通路,植物

当昆虫咬食植物的叶片后，咬食的叶片处会产生信号分子，其中植物会产生一种前体物质经过加工剪切形成成熟的由 18 个氨基酸组成的小肽分子，取名叫系统素[25]，最先在番茄中鉴定到的能够诱导表达蛋白酶抑制剂，通过韧皮部将信号传递至非咬食的叶片，通过与膜上受体识别结合启动信号转导通路。此外植物产生具有挥发性的茉莉酸甲酯分子将信号传递至临近的非咬食的植株叶片[26-28]，从而使局部防御转为系统防御，诱导表达防御蛋白蛋白酶抑制剂，提高植物防御植食性昆虫咬食的能力。研究表明，植物被昆虫咬食之后，除了产生系统素，还可通过 ABA、物理信号和电信号在细胞内启动相同的的信号转导通路[29]，这些信号通过膜信号受体将信号转导至细胞内的脂肪酶，从而促进膜脂质释放亚麻酸，然后，亚麻酸通过脂肪酸途径合成茉莉酸[30, 31]，进一步诱导下游转录因子，调控蛋白酶抑制剂基因的表达。此外，茉莉酸还可以诱导植物叶片产生挥发物，一方面吸引昆虫的天敌食肉动物，保护植物免受昆虫的侵袭，另一方面将信号传递至临近非咬食的叶片，启动胞内信号转导通路。该信号通路会受到其它因素的调控，如乙烯在通路下游促进茉莉酸诱导防御蛋白蛋白酶抑制剂基因的表达[5]，而植物生长素和水杨酸对下游茉莉酸功能具有负调控机制[32]，此外，昆虫的口头分泌物也会促进形成茉莉酸（图 1.2）[5]。

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