黄花嵩转录因子AaWD40的克隆及DXR基因的RNA干扰研究

发布时间：2020-06-30 00:38

【摘要】：黄花蒿(Artemisia annua L.)是菊科(Asteraceae)蒿属(Artemisia)一年生草本植物,主治恶疮、疟疾和寒症等各种发热症。青蒿素是其主要抗疟成分,在黄花蒿腺毛中合成。由于青蒿素化学合成工艺复杂不能用于商业生产,野生黄花蒿资源日益匮乏且青蒿素含量偏低,青蒿素的生物合成研究受到了研究工作者的广泛重视。WD40转录因子基因与植物叶片表面腺毛发育、次生代谢相关。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate Reductoisomerase,DXR)是青蒿素合成中的关键限速酶。对黄花蒿转录因子和关键酶的研究,对了解青蒿素的的生物合成及其调控具有重要的理论意义。本研究利用RACE技术克隆出了AaWD40基因;并利用RNAi探讨了DXR基因与黄花蒿生长发育及青蒿素合成的关系。研究工作主要包括以下三方面:本研究利用RACE技术从黄花蒿中克隆出AaWD40基因,并对其进行了生物信息学分析。AaWD40基因的cDNA全长1 498 bp,其中5'末端非翻译区为209 bp,3'末端非翻译区为183 bp。开放阅读框(ORF)的长度为1 106 bp,编码368个氨基酸残基,DNAMAN分析预测其等电点为4.64,分子量为41.29 kDa。对AaWD40氨基酸序列进行同源性分析,发现其与多种植物具有较高的同源性。生物信息学分析发现AaWD40氨基酸序列含有4个典型的WD40重复区域,符合WD40基因的特征,所以命名为AaWD40。利用Swiss-Model对AaWD40蛋白进行三级结构分析,AaWD40蛋白空间结构错综复杂,与多种植物WD40空间结构域非常相似。系统发育树分析AaWD40与其他WD40均源于同一祖先,并且AaWD40与DpWDR、GhTTG4的亲缘关系最为接近。利用Gateway克隆的技术构建了DXR-RNAi载体,我们根据BLAST的结果选取了一段523 bp的干扰片段。通过BP反应,成功地把目的基因导入到入门载体pDONR221,并通过LR反应构建了目的载体pSGRNAi-DXR,即本实验所需要的RNAi载体。我们应用PCR鉴定、酶切鉴定、测序的方法,确认了载体的成功构建。同时,我们运用冻融法将重组质粒转入农杆菌LBA4404,PCR鉴定结果显示目的载体成功导入农杆菌。根据以上实验基础,我们利用农杆菌介导的叶盘法成功地诱导出了转基因黄花蒿,经过kan抗性筛选共获得36株抗性转基因黄花蒿,并将其和野生型黄花蒿一起炼苗。为后续研究黄花蒿DXR基因功能奠定了基础。利用PCR反应对36株kan抗性植株进行检测,其中有5株获得目的条带,并以黄花蒿Actin为内参,用黄花蒿DXR基因的特异引物进行荧光定量PCR检测,发现转基因植株DXR的表达量比野生型植株显著下调(平均下调了68%),RNAi显著地影响了黄花蒿内源DXR基因的表达。观察发现DXR-RNAi后,转基因黄花蒿的根和茎明显伸长;叶片面积明显减小;腺毛密度明显下降,腺毛大小显著增加。HPLC检测结果表明,DXR-RNAi后青蒿酸和青蒿素含量显著下调,平均减少了39%和58%。研究结果初步证明了DXR基因在黄花蒿根、茎、叶生长和腺毛发育中发挥重要作用,DXR基因能够调控青蒿酸和青蒿素的生物合成。通过本研究,我们首次从黄花蒿中克隆出AaWD40基因,并对其进行了生物信息学分析,为进一步研究AaWD40与黄花蒿生长发育,尤其是与黄花蒿腺毛发育的潜在关系提供了理论基础。同时本研究利用RNAi技术,分析了DXR基因在黄花蒿生长及青蒿素代谢中的重要调控功能,发现其影响黄花蒿生长、腺毛发育及青蒿素生物合成。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.219;Q943.2

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本文编号：2734593