携载YCD-Connexin26基因纳米微泡杀伤膀胱癌细胞的实验研究

发布时间：2020-06-29 20:41

【摘要】：目的:制备出能运载YCD/Cx26双质粒的纳米阳离子微泡;分析载双质粒的纳米阳离子微泡结合超声辐照进行基因转染的有效性;探索上调膀胱癌细胞的缝隙连接蛋白connexin26(Cx26)表达,能否增强自杀基因系统YCD/5-FC(yeast cytosine deaminase/5-fluorocytosine)的旁观者效应,从而提高消灭肿瘤细胞的效应。方法:运用薄膜水化、物理机械震荡法制备纳米阳离子微泡,利用静电吸附原理及络合效应携载质粒。运用纳米阳离子微泡结合超声辐照转染人膀胱癌T24细胞,电子荧光显微镜及流式细胞仪观测转染效率;RT-PCR及Western blot检测质粒转染后的mRNA与蛋白的相对表达量。CCK-8法比较在5-FC前药诱导下携载不同基因质粒的纳泡转染T24细胞后对细胞存活率影响;流式细胞仪观测Connexin26表达后对膀胱癌细胞凋亡影响。结果:制备出稳定性较好的纳米阳离子微泡(CMB),其平均粒径(472.5±48.57)nm,平均表面电位为+(28.32±2.78)mv。CMB最大基因结合量和结合率分别为4μg/10~8个微泡和66.7%。一定超声辐照条件下,质粒转染效率为(30.28±2.04)%。RT-PCR、Western blot均证实纳米阳离子微泡结合超声辐照这一基因递送新方式,能成功将目的基因转染入细胞并高效表达。当质粒YCD:Cx26量比为5:5转染,前药5-FC(300μmol/L)诱导24h后:T24细胞存活率为(42.3±4.6)%;Cx26表达后,载YCD-Cx26纳米阳离子微泡组的细胞凋亡率为(60.68±2.61)%,明显高于单载YCD基因纳米阳离子微泡组的(46.42±2.13)%,差别有统计学上意义(P0.01)。结论:CMB可提高质粒运载能力,结合超声辐照有效提高转染效率并使目的基因成功表达。Connexin26表达后,直接改善细胞间通讯连接,增强自杀基因系统YCD/5-FC的旁观者效应,促使肿瘤细胞凋亡,提高杀伤膀胱癌T24细胞的效率。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14
【图文】：

酶切电泳,重组质粒,质粒

轻微混合均匀后，避光条件下常温反应 15min 后送流式上机检测计学分析用 SPSS 24.0 统计软件进行数据处理。满足方差齐性及正态分布的组间相比较则采用单因素方差分析法，两组间比较可采用 t 检验；秩和检验。以 P＜0.05 为差异有统计学意义。组质粒的鉴定过双酶切的质粒 DNA 电泳后会呈现两条高亮条带，一条为重组质粒一条为目的基因片段，说明酶切位点正确；而未经过酶切的质粒 DN超螺旋、线性、开环三条或以上的高亮条带。基因测序结果与 Gen序列相比对,序列完全正确, 无任何碱基突变，己成功扩增了 YCD A 序列（图 1）。

YCD-pcDNA-EGFP 质粒

【参考文献】