魁蚶血红蛋白基因的克隆及功能分析

发布时间：2020-06-29 20:01

【摘要】：魁蚶是一种富含蛋白质和维生素B12的海洋软体动物,肉质鲜美,具有良好的市场前景和经济价值。前期研究发现,魁蚶具有较强的抗逆境能力,而且血细胞中具有红细胞,这是有别于其他多数贝类的重要特征之一。血红蛋白是红细胞的重要成分,然而,目前有关魁蚶血红蛋白的研究非常有限。为进一步明确魁蚶血红蛋白的基因结构及功能作用,本文对比了魁蚶、栉孔扇贝和四角蛤蜊在低氧胁迫后的生存状态;克隆了3种魁蚶血红蛋白基因并对其表达特性进行了研究分析;通过体外表达,得到了2种魁蚶血红蛋白的重组蛋白,研究了其酶活特性。本研究丰富了贝类血红蛋白的研究资料,为魁蚶抗逆机制等方面的研究提供了参考。溶氧是影响水生动物存活、生长和能量代谢等重要的环境因子之一,自然水体中经常会出现周期性低氧和连续性的低氧现象。贝类在受到低氧胁迫后,会产生许多的应对机制,不同贝类耐低氧能力存在很大的差别。本文通过对魁蚶(Scapharca broughtonii)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和四角蛤蜊(Mactra veneriformis)在4.5 mg/L、2.5 mg/L和0.5 mg/L溶氧量下的生存状态、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)的研究发现,在相同溶氧浓度情况下,魁蚶的存活率高于栉孔扇贝和四角蛤蜊,且在2.5 mg/L和0.5 mg/L组中从1天后开始呈极显著差异(p0.01);魁蚶的半致死浓度比栉孔扇贝和四角蛤蜊低,在3天时,魁蚶的LC50仅为1.97,而栉孔扇贝和四角蛤蜊的分别为4.46和4.09;鳃、外套膜和血液中SOD酶活性和T-AOC虽有不同程度的变化,但随着胁迫时间的延长,至72 h时魁蚶组基本能恢复到对照组水平,而栉孔扇贝和四角蛤蜊低于对照组,且栉孔扇贝组呈极显著差异(p0.01)。本研究发现魁蚶有着比栉孔扇贝和四角蛤蜊更强的低氧耐受能力。血红蛋白在高等动物中分布广泛,具有运载氧气和维持渗透压等多种重要功能。软体动物中血红蛋白的相关研究较少,有关血红蛋白基因免疫功能的研究越来越受到关注。本研究以从魁蚶转录组数据库中获得的部分序列为基础,通过c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆获得了三种魁蚶血红蛋白基因c DNA全长序列(命名为Sb Hb IIA、Sb Hb IIB和Sb Hb IIC),并进行了不同条件下m RNA表达研究。序列和结构分析表明,Sb Hb IIA基因c DNA全长为867 bp,其中包括长度为483 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码160个氨基酸,预测蛋白分子量为17.5 k Da,理论等电点为9.68;Sb Hb IIB基因全长946 bp,包含459 bp的ORF,ORF编码152个氨基酸残基,预测蛋白分子量为17.1 k Da,理论等电点为5.10;Sb Hb III C基因c DNA全长为916 bp,包括447bp的ORF,编码148个氨基酸残基,预测蛋白分子量为15.8 k Da,理论等电点为7.944。氨基酸序列具有多个血红素结合位点,具有血红蛋白的特征序列,与毛蚶和泥蚶等近缘物种的血红蛋白序列具有较高相似度,达80%以上,系统进化树中也先与蚶科贝类血红蛋白聚为一支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)结果表明,3种血红蛋白基因变化趋势具有较高的一致性。在魁蚶成体的斧足、鳃、外套膜、闭壳肌、血淋巴、肝胰腺,以及受精卵至发育23天的幼虫体内均能检测到转录本;且在成体血淋巴中表达量最高,与其他5个组织表达量存在极显著差异(p0.01);在受精卵至23d幼虫期的表达变化中,Sb Hb IIA、Sb Hb IIB和Sb Hb IIC都是从发育的第12天时表达量开始急剧上升(p0.01),达到最低值的200倍以上;低氧胁迫后血淋巴中基因表达量呈先上升后下降的趋势,4.5 mg/L、2.5 mg/L和0.5 mg/L处理组都是在16 h达到最高值,Sb Hb IIA、Sb Hb IIB和Sb Hb IIC的表达量都达到了对照组的4倍以上;鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后,3种血红蛋白基因的表达均呈先上升后下降的趋势,但表达量最高值存在差异,Sb Hb IIA和Sb Hb IIB的表达高峰出现在16 h,而Sb Hb IIC的表达高峰出现在32 h,结果证明魁蚶血红蛋白在应对低氧胁迫和鳗弧菌侵染反应过程中发挥了极其重要的作用,属于一种免疫因子。利用体外重组表达技术获得Sb Hb IIB和Sb Hb IIC基因的重组蛋白(命名为r Sb Hb IIB和r Sb Hb IIC),通过与L-DOPA底物反应,证明了其具有类酚氧化酶活性(phenoloxidase-like activity,PO-like activity)。r Sb Hb IIB蛋白PO-like活性最适PH和温度分别为5.0和30℃,而r Sb Hb IIC的最适p H和温度为7.4和40℃。多种氧化酶抑制剂(抗坏血酸、硫脲、柠檬酸等)和金属螯合物(EDTA)对重组蛋白PO-like活性有着显著的影响。金属离子(Fe2+、Zn2+、Cu2+等)对其酶活影响差别较大,Mg2+和Ca2+对PO-like酶活性基本没有影响,Cu2+等会显著抑制其酶活性,但Fe2+对其酶活有着促进作用。通过实验也验证了Fe2+能恢复EDTA预处理过的重组蛋白的PO-like活性。抑菌实验表明,r Sb Hb IIB和r Sb Hb IIC能够明显抑制鳗弧菌的生长。本研究从m RNA和蛋白水平均验证了魁蚶血红蛋白具有抑菌功能,为魁蚶后续免疫功能相关方面的研究提供了基础资料。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

四角蛤蜊,魁蚶,栉孔扇贝,SOD酶活力

时 4.5 mg/L 组比对照组升高，其他组的酶活性基本恢复到对照组水平，而四角蛤蜊酶活性也有明显下降，至 72h 时明显低于对照组。栉孔扇贝 24h 时只有 4.5mg/L 组有明显升高，其他组均有降低，且 24 h 后的各时间点 4.5 mg/L、2.5 mg/L和 0.5 mg/L 组的酶活性低于对照组（p<0.01）。低氧胁迫后外套膜中 SOD 酶活变化情况见图 1-2。魁蚶、栉孔扇贝和四角蛤蜊都是在低氧处理后 24 h 的 4.5 mg/L 组出现酶活性最高值，同一时间段随着溶氧浓度的降低，SOD 酶的活力明显出现下降。魁蚶和栉孔扇贝在同一溶氧水平组随着处理时间的延长，其酶活性比对照组都有着明显的降低。四角蛤蜊组在处理 48 h 后除 4.5 mg/L 组的高于对照组，其他组基本恢复到对照组水平。魁蚶、栉孔扇贝和四角蛤蜊血液中SOD酶的活力变化见图1-3。3种贝类SOD酶活力在 4.5 mg/L 组胁迫 24 h 和 48 h 后明显高于对照组，且随着溶氧水平的降低，其 SOD 酶活性降低明显，栉孔扇贝组在 24 h 的 2.5 mg/L 组就明显低于对照组，魁蚶是在处理 48 h 后的 2.5 mg/L 组开始低于对照组。四角蛤蜊在处理 48 h后除 4.5 mg/L 组外其他组 SOD 酶活力基本回复到对照组水平。

四角蛤蜊,魁蚶,栉孔扇贝,溶氧

其 SOD 酶活性降低明显，栉孔扇贝组在 24 h 的 2.5 mg/L 组就明显低于对照组，魁蚶是在处理 48 h 后的 2.5 mg/L 组开始低于对照组。四角蛤蜊在处理 48 h后除 4.5 mg/L 组外其他组 SOD 酶活力基本回复到对照组水平。图 1-1 溶氧对魁蚶（A）、栉孔扇贝（B）和四角蛤蜊（C）鳃中 SOD 酶活力的影响Fig 1-1 Effect of DO on activities of SOD in the gills of Scapharca broughtonii (A), ChlamysFarreri (B) and Mactra veneriformis (C).不同小写字母间表示差异显著（p<0.05），不同大写字母间表示差异极显著（p<0.01）。Different lowercase letters indicate significant difference (p<0.05), Different capital lettersindicate highly significant difference (p<0.01).

【参考文献】