TaCYP78A5基因过表达小麦的遗传和功能初步分析

发布时间：2020-07-01 17:48

【摘要】：为了验证小麦籽粒大小相关基因TaCYP78A5在小麦籽粒发育中的功能,对pINO启动子驱动的TaCYP78A5基因过表达的转基因小麦后代株系进行了鉴定,检测了T_0代植株目标基因拷贝数,定量分析了7个T_1代阳性植株的目标基因表达,并对其籽粒大小进行了统计。结果表明,利用Bar试纸条和目标基因特异PCR检测相结合的方法对21株转基因T_0代再生苗进行检测,共鉴定出14个阳性植株,除2个植株的目标基因拷贝数为3和1个植株为7外,其余11个T_0代转基因植株目标基因插入拷贝数均为1~2个,其中有6个单拷贝植株。与野生型相比,7个T_1代阳性植株目标基因表达量均极显著增加,粒厚和粒宽均有不同程度增加,粒重极显著增加。
【图文】：

Ｔ０代转基因植株进行了Ｂａｒ试纸条检测及多次重复ＰＣＲ检测，图２Ａ中Ｂａｒ试纸条检测结果显示，阴性对照（野生型ＪＷ１）和阴性转基因植株只显示一条控制线，而阳性转基因植株则可同时显出控制线和检测线；图２Ｂ中ＰＣＲ检测检测结果显示，空白对照（ｄｄＨ２Ｏ）和阴性对照（野生型ＪＷ１）基因组均没有扩增出预期目的条带，而阳性对照（ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１－ＴａＣＹＰ７８Ａ５质粒）与阳性转基因植株可扩增出与理论值一致的１３５３ｂｐ目的条带。从图２中可以看出，Ｂａｒ试纸条检测结果与ＰＣＲ检测结果一致，２１株转基因再生苗中共鉴定出１４株阳性植株。２．２Ｔ０代转基因植株的转入基因拷贝数以Ｔ０Ａ５－２１的基因组ＤＮＡ（５倍的稀释，设置５个梯度）作为模板进行实时定量ＰＣＲ，得到Ｐｉｎｂ和ＴａＣＹＰ７８Ａ５基因的扩增曲线，并以模板浓度（Ｃ）的Ｌｏｇ值和对应的Ｃｔ值为Ｘ轴和Ｙ轴，得到Ｐｉｎｂ和ＴａＣＹＰ７８Ａ５基因的标准曲线（图３）。２个基因的扩增标准曲线的相关系数都为０．９９８，接近于１，所以得到的标准曲线可以用于测定Ｔ０代转基因植株的目标基因拷贝数。分别以各转基因阳性植株的基因组ＤＮＡ为模板，用内参基因Ｐｉｎｂ和ＴａＣＹＰ７８Ａ５基因特异引物和探针进行ＴａｑＭａｎ实时定量ＰＣＲ扩增，每个待测样品设定３个重复，得到其Ｃｔ值（表２），参照刘振华等［１４］和Ｗｅｎｇ等［１５］的方法进一步计算各转基因阳性植株中目标基因的拷贝数（表２）。农杆

图３内参基因Ｐｉｎｂ（Ａ）和目标基因ＴａＣＹＰ７８Ａ５（Ｂ）的扩增标准曲线Ｆｉｇ．３ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｓｏｆｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅＰｉｎｂ（Ａ）ａｎｄｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅＴａＣＹＰ７８Ａ５（Ｂ）表２转基因植株目标基因ＴａＣＹＰ７８Ａ５的拷贝数Ｔａｂｌｅ２ＣｏｐｙｎｕｍｂｅｒｏｆＴａＣＹＰ７８Ａ５ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ转基因植株ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔＣｔ（Ｐｉｎｂ）Ｃｔ（ＴａＣＹＰ７８Ａ５）Ｘ拷贝数估测值ＥｓｔｉｍａｔｅｄｃｏｐｉｅｓＴ０Ａ５－１２７．２２±０．０４０３０．１６±０．００５０．１４１Ｔ０Ａ５－２２６．５６±０．０５０２７．４８±０．０３００．７３１Ｔ０Ａ５－３２５．１３±０．０２５２４．６７±０．０３０２．６８３Ｔ０Ａ５－４２７．６４±０．０１０２７．７６±０．０１０１．１８２Ｔ０Ａ５－６２５．１１±０．０３０２５．１１±０．１１０１．８７２Ｔ０Ａ５－１０２５．８３±０．０１５２４．１０±０．１６５６．５８７Ｔ０Ａ５－１３２５．４９±０．０８０２６．４４±０．０５００．８４１Ｔ０Ａ５－１５２５．３５±０．０２０２６．４９±０．０１５０．７６１Ｔ０Ａ５－１６２６．３３±０．０１０２６．２９±０．０１０１．６１２Ｔ０Ａ５－１８２６．３１±０．０１５２７．３８±０．０７５０．６７１Ｔ０Ａ５－１９２５．０９±０．０３５２４．９６±０．０３５２．０８３Ｔ０Ａ５－２１２６．０２±０．０２５２６．０１±０．１００１．６５２Ｔ０Ａ５－２２２８．７２±０．０２０２８．２８±０．０２５１．５６２Ｔ０Ａ５－２４２８．２６±０．０

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本文编号：2737085